Induziert pluripotente Stammzellen iPS

Die vollautomatisierte Herstellung

  • Abb. 1: Zentrale HandlingeinheitAbb. 1: Zentrale Handlingeinheit
  • Abb. 1: Zentrale Handlingeinheit
  • Abb. 2: Hochdurchsatzmikroskop zur Kontrolle
  • Abb. 3: Mikroskop für die automatisierte Zellernte
  • Abb. 4: Seitenansicht der Anlage

Um induziert pluripotente Stammzellen, sogenannte iPS-Zellpopulationen in einer guten und vergleichbaren Qualität zu erhalten, muss der Herstellungsprozess unter reproduzierbaren und kontrollierten Prozessbedingungen erfolgen. Diesem Ziel hat sich ein Projektkonsortium im Rahmen eines dreijährigen Ziel2.NRW Projektes (www.stemcellfactory.de) verschrieben und unter maßgeblicher Beteiligung des Fraunhofer Instituts für Produktionstechnologie IPT aus Aachen eine vollautomatisierte Produktionsanlage konzipiert.

Die Anlage wurde vor kurzem beim Projektpartner Life & Brain in Bonn aufgebaut und wird zurzeit biologisch validiert. Motivation für diese Vollautomatisierung kompletter biologischer Prozessabläufe war nicht nur die Tatsache, dass große Mengen an iPS Zellen manuell nur sehr aufwändig zu erzeugen sind, sondern auch die Erfahrung, dass die manuelle Produktion von iPS-Zellpopulationen starken Parameterschwankungen unterliegt und eine hohe Anzahl an undefinierten Einflüssen mit sich bringt. Einflüsse wie Erfahrung, Geschicklichkeit als auch Verfassung des Personals haben direkte Auswirkungen auf die Qualität der erzeugten iPS-Zellen. Darüber hinaus kann davon ausgegangen werden, dass die Konzentration an eingeschleusten Keimen durch manuelle Prozesse selbst unter Sicherheitswerkbänken immer höher ist als bei einer geschlossenen sterilen Produktionsumgebung.

Das System
Eine Automatisierung in diesem Umfeld ist allerdings sehr anspruchsvoll. Neben einer reproduzierbaren Qualität liegt die besondere Herausforderung in der Etablierung von Hochdurchsatzverfahren zur Isolation und Analyse einer möglichst großen Zahl von patientenspezifischen iPS-Zellpopulationen inklusive einer entsprechenden online Qualitätskontrolle (AICES, RWTH Aachen).

Nichtdestotrotz war und ist es das Ziel des Projektes, eine automatisierte Produktion von Stammzellen hoher und gleichbleibender Qualität zu ermöglichen. Dafür arbeiten Biologen und Ingenieure Hand in Hand und realisieren biologische Abläufe rein mit technischen Mitteln.

Dabei wird auf industrielle Standards gesetzt.

Zu diesem Zweck wurde von Anfang an auf eine Industrie bewährte speicherprogrammierbare Steuerung (SPS) zurückgegriffen, welche die meisten Anlagenkomponenten verbindet und steuert. Durch die Nutzung einer SPS ist eine hohe Anlagenstabilität erreicht worden, welche Windows basierten Systemen weit voraus ist.

Ein 6-Achsen Knickarmroboter (KUKA) stellt die zentrale Handling-Einheit der Anlage dar und bietet Flexibiltät und Robustheit bei der Verbindung aller Prozessabläufe. Der Roboter ist hierfür mit einem flexiblen Universalgreifer ausgestattet, der sowohl Mikrotiterplatten (MTPs) als auch Pipettenboxen und Falcon Tubes greift und positioniert. Ein Greiferwechsel ist daher nicht nötig. Um den Arbeitsbereich des Roboters zu vergrößern, wurde er auf einer Linearachse (Bosch Rexroth) platziert.

Alle benötigten Materialien werden über zwei Magazine in die Anlage eingeschleust. Die Magazine sind modular aufgebaut und mit verschiedenen Stellplätzen für MTPs, Pipettenboxen als auch beheizbaren und gekühlten Plätzen für Falcon Tubes versehen. Die Positionierung der Magazine erfolgt über zwei elektrisch angetriebene Drehtische, welche wiederum von der SPS gesteuert werden. Durch die steife Lagerung als auch den exakten Schrittmotor mit integriertem Encoder ist eine hochpräzise Positionierung von einzelnen „Disposables“ möglich. Dies führt zu einem robusten Greifprozess seitens des Roboters. Um einen möglichst hohen Sterilisationsgrad einzuhalten, liegen die Magazine in einem separierten Bereich der Anlage und sind durch den Einsatz von Trennwänden von der Liquid Handling Einheit (LHU) abgeschottet. Die LHU ist eine Entwicklung des Projektpartners Hitech Zang, welche an die speziellen Anforderungen der iPS-Zellgenerierung angepasst wurde. Sie verfügt über mehrere Stellplätze für Mikrotiterplatten als auch für Falcon Tubes und Pipettenboxen. Weiterhin verfügt sie über Sensorik zur Detektion von Füllständen sowie zur Kompensation von Pipettentoleranzen. Die zahlreichen Zwischenspeicher für Medien sind beheizbar und verfügen über Deckel, die einen zusätzlichen Schutz vor Kontamination bieten.

Ein automatisierter Inkubator wird vom Roboter beladen und bietet Platz für 400 Mikrotiterplatten. Auch hier werden Parameter wie Einschleusen, Ausschleusen als auch die Werte für Temperatur und CO2 von der SPS geregelt.

Prozesskontrolle
Ein ganz besonderes Merkmal ist die integrierte Messtechnik. Dazu zählen ein Zellzählgerät, ein Mikrotiterplatten-Reader zur Kontaminationskontrolle, ein Gerät zur automatisierten Zellernte mit integriertem Mikroskop, ein separates eigens entwickeltes Hochdurchsatz-Mikroskop für die regelmäßige mikroskopische Kontrolle und eine Kamerastation für einen makroskopischen Überblick sowie eine nicht-invasive pHWert Messung.

Weiterhin verfügt die Anlage über eine automatisierte Zentrifuge, welche neben Falcon Tubes auch in der Lage ist, Mikrotiterplatten zu zentrifugieren. Diese wird ebenfalls vom Roboter beladen und über die SPS mit Parametern bezüglich Drehzahl und Zentrifugierzeiten vorkonfiguriert. Für einen sicheren Zentrifugierprozess wurden alle relevanten Sensoren der Zentrifuge direkt mit den Ein- und Ausgängen der SPS verbunden. Dies erlaubt eine sichere Benutzung der Zentrifuge und schließt Bedienerfehler durch Analyse von sicherheitsrelevanten Signalen aus.

Eine übergeordnete Leitebene dient als Kommandozentrale für die gesamte Anlage, die manuell über Benutzereingaben an einem Touchscreen gesteuert werden kann und in Zukunft auch in einem vollautomatisierten Betrieb ohne Benutzerinteraktion laufen wird (WZL, RWTH Aachen). Zentrale Herausforderung ist hierbei ein effizientes Zeitmanagement der einzelnen Prozessschritte, um lange Wartezeiten zu vermeiden sowie eine hohe Parallelität in der Prozessbearbeitung zu erreichen. Das dynamische Zeitmanagement kontrolliert dabei den Ablauf jeder einzelnen Mikrotiterplatte. Hierdurch wird einerseits die nötige Prozessflexibilität, als auch eine Einhaltung von vergleichbaren Prozesszeiten erreicht. Die regelmäßig generierten Mess- und Bilddaten innerhalb der Anlage dienen nicht nur der Dokumentation aller Kultivierungsprozesse, sondern spielen eine zentrale Rolle für die Prozesssteuerung. So werden unter Anderem ideale Zeitpunkte für Aktionen wie z.B. einen Medienwechsel messtechnisch vorgegeben und dann termingerecht durchgeführt. Somit ist eine individuelle Prozessführung für jede einzelne Zellkolonie gewährleistet. Man darf gespannt sein, wie sich dies auf die Qualität der in Kürze weltweit erstmals vollautomatisiert produzierten iPS Zellen auswirken wird. Das Projekt wird von der Europäischen Union (Europäischer Fonds für regionale Entwicklung – Investition in unsere Zukunft) und dem Land NRW im Rahmen des NRW / EU-Ziel2-Programms 2007-2013 gefördert.

Weitere Beiträge zum Thema: http://bit.ly/GIT-Stammzellen
Webcast zum Beitrag unter: http://bit.ly/Stammzellvideo

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Fraunhofer-Institut für Produktionstechnologie IPT
Steinbachstr. 17
52074 Aachen
Germany
Telefon: +49 241 8904-0
Telefax: +49 241 8904 198

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