Kernmagnetische Resonanz

Vielfältige Anwendungen in der Strukturbiologie neurodegenerativer Erkrankungen

  • Abb. 1: Hochfeld NMR-Spektrometer mit einer Magnetfeldstärke von 21.14 T in der Abteilung für NMR-basierte Strukturbiologie am Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie in Göttingen.Abb. 1: Hochfeld NMR-Spektrometer mit einer Magnetfeldstärke von 21.14 T in der Abteilung für NMR-basierte Strukturbiologie am Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie in Göttingen.
  • Abb. 1: Hochfeld NMR-Spektrometer mit einer Magnetfeldstärke von 21.14 T in der Abteilung für NMR-basierte Strukturbiologie am Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie in Göttingen.
  • Abb. 2: Schematische Darstellung der Amyloidbildung und möglicher Ansatzpunkte zur Intervention. a) Bevor globuläre Proteine zu Amyloidfibrillen aggregieren ist eine partielle Entfaltung nötig, die eine Konvertierung von der nativen Struktur zur β-faltblattreichen Struktur der Fibrille ermöglicht. b) Der Aggregationsprozess von IDPs beginnt mit der Bildung löslicher Oligomere, die weiter zu Protofibrillen und schließlich zu unlöslichen Amyloidfibrillen aggregieren. Es wird gegenwärtig angenommen, dass es die oligomeren Übergangsformen sind, die toxisch für die Zelle sind. Unter normalen Bedingung kann die Aggregation durch c) zelluläre Faltungshelfer, sog. Chaperone, verhindert werden oder d) die Oligomere werden durch bestimmte Enzyme, die Proteasen, abgebaut. Unter pathologischen Bedingungen sind beide Prozesse gestört und eine Wiederherstellung ihrer Funktion bietet therapeutisches Potential. Der Aggregationsprozess kann ebenfalls durch kleine organische Verbindungen beeinflußt werden (e,f). So bewirkt die Bindung von Pthalocyanintetrasulfonat (PcTS) an das IDP (Intrinsically Disordered Protein) Tau die Bildung unstrukturierter, nicht toxischer Oligomere, die nicht weiter zu Amyloiden aggregieren können (e). f) Andere organische Verbindung wie Phenothianzine (PTz) verhindern die Entstehung von Oligomeren und bewahren den monomeren Zustand von Tau (siehe Text).
  • Abb. 3: a) Posttranslationale Modifikationen ändern die chemische Verschiebung der betroffenen Reste, die eine Unterscheidung der unmodifizierten (A, B) von den modifizierten Resten (A*, B*) im NMR-Spektrum ermöglicht. Der Modifizierungsgrad wird aus dem Quotienten der Peakintensität des modifizierten Restes und der Summe der Peakintensitäten von modifizierten und unmodifizierten Rest [Imod/(Imod+Iunmod)] berechnet. b) Eine Analyse der Veränderung des Modifizierungsgrades als Funktion der Zeit erlaubt kinetische Parameter der Reaktion wie Geschwindigkeitskonstanten zu bestimmen. Ein Vergleich dieser Parameter erlaubt es Aussagen zu treffen, welche Reste bevorzugt modifiziert werden.

Die Kernmagnetische Resonanz-Spektroskopie oder NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ist eine strukturbiologische Methode, die eine strukturelle Charakterisierung von Biomolekülen mit atomarer Auflösung erlaubt. NMR wird in Lösung oder als Festkörper-NMR durchgeführt. Im Gegensatz zur Röntgenstrukturanalyse ermöglicht es die Lösungs-NMR Biomoleküle unter nahezu physiologischen Bedingungen zu analysieren.

Grundlagen der NMR-Spektroskopie
Grundvoraussetzung für die NMR sind sehr starke und extrem homogene Magnetfelder; die Magnetfeldstärken moderner NMR-Spektrometer liegen zwischen 14,1-23,5 T (Abb. 1). Atomkerne können sich, da sie selbst kleine Magnete sind, innerhalb eines Magnetfeldes entweder parallel zu diesem oder antiparallel ausrichten (dies gilt nur für sogenannte Spin ½ Kerne wie das Proton). Der Energieunterschied zwischen beiden Zuständen entspricht einer Frequenz multipliziert mit dem Planckschen Wirkungsquantum. Diese Frequenz, allgemein auch als „chemische Verschiebung" bezeichnet, ist spezifisch für jeden Atomkern, da sie von der elektronischen Umgebung des Atoms abhängt und somit von der Struktur des Biomoleküls. Neben der chemischen Verschiebung gibt es noch eine Vielzahl weiterer NMR-Parameter mit denen Informationen über intra- oder intermolekulare Distanzen, die Geometrie chemischer Bindungen, die Starrheit des Proteingerüstes oder die Orientierung von Proteindomänen zueinander gewonnen werden können.

Verglichen mit anderen Spektroskopieformen ist die NMR eine relativ unempfindliche Methode und benötigt Proteinmengen von mikro- bis millimolarer Konzentration. Daher ist die Entwicklung leistungsfähigerer Spektrometer mit höheren Feldstärken von großer Bedeutung, da diese eine höhere Sensitivität wie auch bessere Auflösung ermöglichen. In der Protein-NMR werden gewöhnlich nicht nur Protonen (1H) sondern auch Kohlenstoff- und Stickstoffkerne untersucht. Dies verbessert die Auflösung in mehrdimensionalen Spektren und liefert wertvolle Informationen über die Struktur von Biomolekülen. Im Gegensatz zu Protonen sind die natürlich vorkommenden Isotope von Kohlenstoff und Stickstoff NMR-inaktiv.

Daher müssen Proteine selektiv durch geeignete Expressionsverfahren in Bakterien mit den NMR-aktiven Isotopen 13C und 15N markiert werden.

Strukturbiologie der Fehlfaltung von Proteinen
Die Fehlfaltung von Proteinen kann gravierende Folgen haben, wie die Amyloidbildung in vielen neurodegenerativen Krankheiten zeigt. Ein Beispiel hierfür ist Transthyretin, welches im nativen Zustand ein Homotetramer bildet, sich aber unter pathologischen Bedingungen in Amyloidfibrillen umfaltet. Amyloidfibrillen als β-faltblattreiche Proteinaggregate sind strukturell sehr verschieden von der nativen Struktur von Transthyretin. Die Amyloidbildung beginnt mit einer partiellen Entfaltung des Transthyretin in Monomere. Dabei kommt es zu strukturellen Änderungen, die zum einen die Oligomerisierung durch nichtnative Proteinkontakte, zum anderen die Umwandlung in die β-Faltblattstruktur der Amyloidfibrille erleichtern (Abb. 2). Daher bilden partiell gefaltete Übergangsformen von Proteinen eine Schlüsselrolle im Bereich neurodegenerativer Erkankungen.

Kältedenaturierung zur Studie von Übergangsformen in der Proteinfaltung [1]
Wie wir am Beispiel des Homodimers CylR2 zeigen konnten, können derartige Übergangsformen durch Kältedenaturierung isoliert werden. Die Kältedenaturierung ist im Gegensatz zur Hitzedenaturierung reversibel. Mittels konventioneller NMR-Methoden bestimmten wir sieben dreidimensionale Strukturen von CylR2 zwischen 25 und -16 °C. Die Strukturen zeigen, dass unterhalb -3 °C eine zunehmende Destabilisierung des dimeren Zustand einsetzt. Unterhalb -11 °C existiert CylR2 ausschließlich in monomerer Form, wobei die Struktur des Monomer der nativen Struktur im Dimer sehr ähnlich ist. Nach Dissoziation besitzt der partiell gefaltete Zustand innerhalb der Kontaktstelle des Dimers viele nichtnative Interaktionen der Seitenketten. Im Falle von Transthyretin oder anderen amyloidformenden Proteinen könnten solche nichtnativen Interaktionen hydrophobe Seitenketten exponieren und somit die Aggregation begünstigen.

Modulation der physiologischen Funktion durch posttranslationale Modifikationen
Die Aggregation der Polypeptide Amyloid-beta, Tau und α-Synuklein nimmt eine zentrale Rolle in der Pathologie der Alzheimer- und Parkinson-Erkrankung ein (Abb. 2). Ihre Aggregation führt zu einem Absterben von Nervenzellen und dem Abbau kognitiver Funktionen. Alle drei Proteine gehören zu den sogenannten natürlich ungeordneten Proteinen oder IDPs (Intrinsically Disordered Proteins). IDPs besitzen keinerlei feste Sekundär- oder Tertiärstruktur und üben ihre Funktion im ungeordneten Zustand aus. Da sich IDPs nicht kristallisieren lassen, ist NMR gegenwärtig die einzige experimentelle Methode, die strukturelle Informationen über IDPs mit atomarer Auflösung liefern kann. So eignet sich NMR nicht nur dazu transiente Strukturelemente zu identifizieren [2], sondern auch dazu Bindungsstellen von Interaktionspartnern und dazugehörige Bindungskonstanten zu bestimmen.

Die physiologische Funktion von Tau ist es Proteine des Zytoskeletts, die sogenannten Mikrotubuli (MT), in den Axonen von Nervenzellen zu stabilisieren. Fehlt diese Stabilisierung, depolymerisieren die MT und die axonale Struktur bricht zusammen, mit gravierenden Folgen für die Signalweiterleitung im Gehirn. Bindet Tau an MT, so kommt es zu einem Intensitätsverlust der an der Bindung beteiligten Reste. Da die nicht an der Bindung beteiligten Reste ihre Flexibilität behalten und keinen NMR-Signalverlust zeigen, lassen sich die MT-Bindungsstellen in Tau genau lokalisieren [2]. Viele physiologische Funktionen wie die MT-Bindung von Tau werden durch posttranslationale Modifikationen reguliert. Im Falle von Tau vermindert Phosphorylierung dessen Affinität für MT. Modifikationen wie Phosphorylierung bewirken diagnostische Änderungen in den NMR-Signalen, wodurch sich die betroffen Reste leicht identifizieren lassen. Wie unsere NMR-Studien mit phosphoryliertem Tau zeigten, interagieren die MT-Bindungsstellen von einander unabhängig mit MT [3]. Je nach Position der Phosphorylierungsstelle in Tau werden daher die MT-Bindungsstellen unterschiedlich stark beeinflusst. Im Gegensatz zu anderen Methoden wie der Massenspektrometrie kann der Modifizierungsgrad direkt aus dem Spektrum quantifiziert werden (Abb. 3). Selbst mehrere Modifikationen an ein und derselben Aminosäure können genau identifiziert werden. So können die NMR-Spektren von Ne- und Nh-methyliertem Arginin unterschieden werden, während dies aufgrund identischer Massen mit der Massenspektrometrie nicht möglich ist.

Aufklärung der Reaktionsmechanismen von Aggregationsinhibitoren
Die Toxizität von Tau in der Alzheimer Erkrankung ist auf seine Aggregation in toxische Oligomere zurückzuführen (Abb. 2). Obwohl viele organische Verbindungen existieren, die diesen Prozess an verschiedenen Stellen unterbinden können und sich als Medikamente eignen würden, ist die Wirkungsweise der meisten Verbindungen unbekannt. Mit Hilfe von NMR und anderen Methoden konnten wir die Wirkungsweise zweier Verbindungen aufklären.

So konnten wir zeigen, dass Pthalocyanintetrasulfonat (PcTS) selektiv an aromatische Aminosäuren in Tau bindet und darüber die Bildung löslicher Tau-Oligomere stimuliert [4]. Diese Oligomere sind nicht toxisch für Nervenzellen und aggregieren nicht zu Amyloidfibrillen. Im Gegensatz dazu stimulieren Phenothiazine wie Methylenblau und seine Derivate Azur A und B keine Oligomerisierung, sondern bewahren den monomeren Zustand von Tau [5]. Die Aggregation von Tau wird dabei durch die Oxidierung der Sulfhydrylgruppen beider Cysteinreste zu Sulfen-, Sulfin- und Sulfonsäuregruppen unterbunden.

Ausblick
Die hier vorgestellten Methoden stellen nur einen Teil der möglichen Anwendungen der NMR-Spektroskopie für die Strukturbiologie dar. Ein weiteres wichtiges Teilgebiet, ist die Untersuchung dynamischer Prozesse in Proteinen. Für viele Proteine ist nicht nur die Struktur für die Funktion entscheidend, sondern auch dynamische Prozesse innerhalb des Proteins. So ist die Funktion von Kanalproteinen in der Mitochondrienmembran abhängig von Strukturänderungen, die ein Öffnen oder Schließen des Kanals ermöglichen [6]. Aufgrund der zentralen Rolle der Mitochondrien für den Energiehaushalt der Zelle, können Störungen der Mitochondrien zu zahlreichen Krankheiten führen. Das große Potential der NMR ist es molekulare Mechanismen der Interaktion von Liganden mit Proteinen aufzuklären, welche als Ansatzpunkte für neue Therapien dienen können.

Literatur
[1] Jaremko M. et al.: Nat Chem Biol 9, 264-70 (2013)
[2] Mukrasch M.D. et al.: PLoS Biology 7, e1000034 (2009)
[3] Schwalbe M. et al.: Biochemistry 52, 9068-79 (2013)
[4] Akoury E. et al.: J Am Chem Soc 135, 2853-62 (2013)
[5] Akoury E. et al.: Angew Chem Int Ed Engl 52, 3511-5 (2013)
[6] Villinger S. et al.: Proc Natl Acad Sci U S A 107, 22546-51 (2010)

Autoren
Martin Schwalbe1 und
Markus Zweckstetter1,2,3

1Deutsches Zentrum für
Neurodegenerative Erkrankungen (DZNE),
Göttingen
2Max-Planck-Institut für
Biophysikalische Chemie
3Universitätsmedizin Göttingen

 

Weitere Beiträge zum Thema: http://bit.ly/Spektroskopie
Mehr Informationen: http://bit.ly/GIT-Alzheimer

 

Kontaktieren

Max Planck Inst. f. Biophysical Chemistry
Am Faßberg 11
37077 Göttingen
Germany
Telefon: +49 551 201 1653

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