Kombiniertes Infrarot- und Massenspektrometrie-Scanning

Hochauflösende, multiparametrische Tiefenanalyse von Geweben im Hochdurchsatz

  • Abb. 1: In einem zweischrittigen Workflow werden Gewebestrukturen aus FTIR-Bildern bioinformatisch abgeleitet. Innerhalb dieser Bilder werden Zellpopulationen unterschiedlicher molekularer Zusammensetzung farbkodiert dargestellt. Die exakte Position auffälliger Strukturen (hier orange dargestellt: ein Hirntumor in einer Maus; rot dargestellt: die Tumor-assoziierte Infiltrationszone) kann mittels Registrierung automatisiert an das nachgeschaltete MALDI-MS übertragen und exklusiv analysiert werden. Dadurch lassen sich Datenlast und Messzeit erheblich verringern. Grafik abgeleitet aus [1].
  • Abb. 2: Infrarotspektroskopie-basierte, simultane Tumorerkennung. Nach einem einzelnen Abgleich des Infrarotscans eines Hirnschnittes einer Maus mit Hirntumor und einer Tumordarstellung in einer Hämatoxylin & Eosin Gewebefärbung können ähnliche Tumoren automatisch in anderen Hirnen dargestellt werden. Dies ermöglicht eine hochauflösende Massenspektrometrie-Bildgebung, die gezielt den Tumor analysiert, wodurch spezifische diagnostische Marker ermittelt werden können. Ein Gehirn (3. von links) wies offenbar keine entarteten Zellen auf. Grafik abgeleitet aus [1].
  • Abb. 3: Gezielte, hochauflösende Akquisition massenspektrometrischer Profile von vordefinierten Areale. Nach der bildgebenden FTIR-Aufnahme eines murinen Hirnquerschnitts, können feine Areale divergierender Zellen (in diesem Fall die hippocampale Körnerzellschicht) über einen Abgleich mit Referenzatlasdaten isoliert werden. Da FTIR zerstörungs- und labelfrei erfolgt können die Positionsdaten für eine darauffolgende hochauflösende MS-Analyse übertragen werden. Dadurch lässt sich insbesondere bei langsamen FTICR-Detektoren eine Reduktion von Messzeit und redundanter Datenlast von bis zu 97.8% erreichen. Grafik abgeleitet aus [1].

Bildgebende Massenspektrometrie (MS) ermöglicht die markierungsfreie, ortsaufgelöste und detaillierte molekulare Charakterisierung von Geweben, bei der pro Bildpunkt Hunderte von Biomolekülen gleichzeitig gemessen werden. Daher rückt diese Technologie für die bildliche Darstellung und die Identifikation diagnostischer sowie therapeutischer Marker immer mehr in den Fokus der biopharmazeutischen Industrie. Für den Einsatz innerhalb einer Hochdurchsatz-Umgebung sind dem Verfahren allerdings derzeit aufgrund der langen Messzeiten und der schwierigen Verarbeitung der immensen Datenmengen noch enge Grenzen gesetzt. Zur massiven Erhöhung des Probendurchsatzes wird hier eine schrittweise Vorgehensweise für Routinemessungen unter Einbindung der Mittelinfrarotspektroskopie vorgestellt.

 
Massenspektrometrie-Bildgebung in der Biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung
Bei der bildgebenden MS werden in einem Screening-Verfahren gleichzeitig tausende ionisierte Biomoleküle ortsaufgelöst erfasst und in Abhängigkeit ihres Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses (m/z) getrennt. Eine weit verbreitete Methode zur Ionisation ist die Matrix-assistierte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI). Dabei werden die Analyten extrahiert, ortsgetreu mit Hilfe einer auf den Gewebeschnitt aufgebrachten Matrixchemikalie fixiert und anschließend mit einem Laser mit sehr präziser Ortsauflösung beschossen. In der biologischen, pharmazeutischen und medizinischen Praxis können auf diese Weise hochdetaillierte Bilder über die molekulare Zusammensetzung und lokale Verteilung von Bioproben gesammelt werden. Pro Biomolekül erhält man dabei ein Bild. Die Einsatzmöglichkeiten sind nahezu grenzenlos – von der Identifikation therapeutischer Marker über die Krebsdiagnostik hin zur Dispositionsanalyse von Arzneistoffen.
 
Technische Weiterentwicklung durch Multimodalität
Trotz ihrer wesentlichen Bedeutung hat die bildgebende MS auch ein paar Nachteile:
i) Die Aufnahme mehrerer hunderttausend Intensitätswerte pro Spektrum führt bei einer Bildpunktgröße von bis zu 10x10 µm zu einer immens hohen Datenlast.
 
ii) Gerade die Verwendung hochauflösender Massenspektrometer erfordert deshalb auch sehr lange Messzeiten, wodurch die Technik in der augenblicklich verfügbaren Technologie-Stufe für Hochdurchsatz-Analysen noch nicht ausgereizt ist.
 
Aus diesen Gründen ergibt sich ein erhebliches Potential, diese essentielle Technik der Biowissenschaften mit Hilfe durchdachter Automatisierung und technologischer Weiterentwicklung weiter voran zu treiben.

Dabei gilt es insbesondere, die Datenlast und Messzeit zu reduzieren, ohne auf räumliche und spektrale Auflösung zu verzichten. In der hier dargestellten Weiterentwicklung wird zu diesem Zweck eine multimodale Verknüpfung zur Infrarotspektroskopie (FTIR, Fourier transform infrared) realisiert. FTIR ermöglicht ergänzend zur MALDI-Massenspektrometrie die zerstörungsfreie Erfassung der biomolekularen Zusammensetzung einer Probe. Und die FTIR lässt sich durch Reduktion der erfassten Wellenlängen extrem beschleunigen. Aus diesen Gründen eignet sie sich letztendlich hervorragend zur schnellen Musteranalyse. Was ihr fehlt, ist die detaillierte Information über individuelle Biomoleküle, die in dieser Komplexität nur vom Massenspektrometer erhalten werden kann. Um die individuellen Stärken beider Techniken zu kombinieren, wird hier eine gerichtete Form multimodaler Bildgebung vorgestellt (Abb. 1). Mit „multimodal“ ist hier die Verbindung des Bildaufnahmemodus Massenspektrometrie mit dem Aufnahmemodus Infrarotspektroskopie gemeint.

In einem zweischrittigen Workflow werden zunächst FTIR-Bilder von Gewebeproben aufgezeichnet und mittels Bildanalysemethoden in mehrere Teilflächen größtmöglicher Strukturgleichheit unterteilt. Die auf diese Weise abgeleiteten Gewebestrukturen werden anschließend automatisiert an das nachgeschaltete Massenspektrometer übertragen, um eine gezielte Tiefenanalyse veränderter Zellpopulationen, wie beispielsweise Tumore, bei minimalem Zeitaufwand zu ermöglichen. Im Folgenden soll anhand zweier Fallstudien gezeigt werden, wie sich mit Hilfe dieses Workflows i) automatisiert Muster krankheitsrelevanter Biomoleküle identifizieren lassen und ii) eine hohe Zeitersparnis bei der gezielten Analyse von Feinstrukturen ermöglicht wird.
 
Automatisierte Tumorlokalisation und Markeridentifikation
In einer aktuellen Studie [1] wurden die Gehirne weiblicher CD1 nu/nu Mäuse, die einen Hirntumor aufwiesen, untersucht. Von vier Tieren wurden Dünnschnitte angefertigt und FTIR-Bilder aufgezeichnet. Die als Hirntumor erkannten Areale konnten kenntlich gemacht werden (Abb. 2).
Mit Hilfe der nachgeschalteten bildgebenden Massenspektrometrie konnten nun automatisch viele Massen, letztlich also konkrete Biomoleküle, identifiziert werden, die tumorspezifisch waren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in einem Hirn keine entarteten Zellen vorkamen (Abb. 2). Diese rein durch Mustererkennung aufgestellte Prognose konnte durch anschließende Referenzfärbungen belegt werden.
 
Zeitersparnis bei der Tiefenanalyse vordefinierter Gewebebereiche
Da die Aufnahme von Massenspektrometrie-Daten gerade in Verbindung mit hochauflösenden Geräten, z. B. Magnetresonanz-Massenspektrometern (MRMS), selbst bei kleinen Gewebeproben mehrere Stunden betragen kann, ist es wichtig, eine Vorauswahl der wichtigen und zu untersuchenden Bereiche (ROI; „regions of interest“) treffen zu können. So sind beispielsweise in den dargestellten Hirntumorproben an sich nur die Profile der entarteten Zellen und ihre exakte Lokalisation von Bedeutung. Da es bisher keine Möglichkeit gab, diese ROI gezielt zu vermessen, muss derzeit stattdessen das gesamte Gewebeareal untersucht werden.
Da es sich beim Infrarotscanning um eine markierungs- und zerstörungsfreie Technik handelt, kann mit derselben Probe anschließend noch eine MS-Messung durchgeführt werden. Mit Hilfe mathematischer Methoden können dann die Positionsdaten für IR-abgeleitete, ausgewählte und gegenüber der Gesamtfläche deutlich verkleinerte Zielregionen für die gezielte MS-Bildgebung in diesen ROI an das Massenspektrometer übermittelt werden. In einer hier dargestellten Fallstudie (Abb. 3) konnten bei der gezielten MS-Bildgebung der Körnerzellschicht in der Hippocampus-Hirnregion einer Maus 97.8% Datenlast eingespart werden. Die Messzeit reduzierte sich von 18,2 Stunden auf 24 Minuten, die Datengröße von 35,3 GB auf 700 MB. Diese signifikante Effizienzsteigerung kann durch derzeit laufende Entwicklungen am Forschungszentrum CeMOS (Center for Mass Spectrometry and Optical Spectroscopy) im Rahmen der vom Bundesforschungsministerium BMBF geförderten industriellen Innovationspartnerschaft „Multimodale Analytik und intelligente Sensorik für die Gesundheitsindustrie“ (M2Aind) noch weiter gesteigert werden.
 
Ultraschneller IR-Scanner – Ein Ausblick hinsichtlich Hochdurchsatz
Der Nachteil einer vollständigen Analyse des gesamten Spektralbereiches für jeden Punkt einer Oberfläche liegt in den auch hier zu langen Messzeiten für große zu scannende Flächen (>1 cm2). Durch Verringerung der Zahl der Nachweiswellenlängen lässt sich die Messgeschwindigkeit jedoch massiv erhöhen. Diese Tatsache macht sich CeMOS derzeit bewusst und arbeitet an der Entwicklung eines hochdurchsatzfähigen Scanners. Er beschränkt sich auf wenige ausgesuchte Wellenlängen im spektralen Mittelinfrarotbereich zwischen 2,5 µm bis 10 µm. Grundsätzlich beruht die entwickelte Technik auf der punktuellen Messung von Absorptionsunterschieden. Der Messpunkt wird über ein sogenanntes Flying-Spot-System auf der Probe ausgelenkt. Nach aktuellem Stand sind Scanfelder von 50 cm2 mit einer Auflösung von 20 µm und einer Messfrequenz von bis zu 300000 Messungen pro Sekunde bereits erfassbar. Die einzelnen Messpunkte werden über komplexe Rechenalgorithmen zu einem Absorptionsbild zusammengefügt. Der gesamte Scanprozess erfolgt hierbei innerhalb einer Minute.
Die erste Entwicklungsstufe führte zur Detektion von lipidhaltigen Substanzen. Auch andere Zielsubstanzen sind durch Anpassung der Laserwellenlängen darstellbar. Der IR-Scanner soll zukünftig breiten Einsatz in der Qualitätskontrolle jeglicher Bereiche finden. Dies kann von der Detektion von Ölrückständen auf sicherheitsrelevanten Gegenständen bis hin zu medizintechnischen Anwendungen führen. Auch die schnelle Analyse von Gewebeschnitten fällt in einen möglichen Aufgabenbereich des IR-Scanners und soll künftig die FT-IR-Spektroskopie bzw. auch die Massenspektroskopie unterstützen. Dabei wird für die entsprechende Applikation zunächst der volle Spektralbereich vermessen, die geeigneten Wellenlängen ausgewählt und ein Gerät für Serienuntersuchung von Proben mit den richtigen Lasern bestückt. Hiermit ist dann die effiziente Qualitätssicherung im Routinebetrieb möglich.
 
Autoren
Jan-Hinrich Rabe1, Tim Kümmel1, Matthias Rädle1, Carsten Hopf1
 
Zugehörigkeit
1Center for Mass Spectrometry and Optical Spectroscopy (CeMOS), Mannheim, Deutschland

 

Kontakt  
Prof. Dr. Carsten Hopf (Massenspektrometrie)
Prof. Dr. Matthias Rädle
(optische Geräteentwicklung)

Center for Mass Spectrometry and Optical
Spectroscopy (CeMOS)
Mannheim, Deutschland
c.hopf@hs-mannheim.de
m.raedle@hs-mannheim.de

 

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Literatur

[1] Rabe, J.-H., et al., Fourier Transform Infrared Microscopy Enables Guidance of Automated Mass Spectrometry Imaging to Predefined Tissue Morphologies. Scientific reports, 2018. 8(1): p. 313-313.

Kontaktieren

Center for Mass Spectrometry and Optical Spectroscopy (CeMOS)


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