LAMP DNA Analytik mit homogener Farbreaktion

Schneller molekularbiologischer Nachweis des Plum pox virus

  • Abb. 1: Typische Symptome der Scharka-Virose auf Blatt, Frucht und in der FruchtAbb. 1: Typische Symptome der Scharka-Virose auf Blatt, Frucht und in der Frucht
  • Abb. 1: Typische Symptome der Scharka-Virose auf Blatt, Frucht und in der Frucht
  • Abb. 2: RT-LAMP mit einer Verdünnungsreihe einer PPV positiven (+) und einer negativen (-) Probe
  • Abb. 3: Schematischer Ablauf der LAMP (ausführliche Beschreibung im Text)
  • Abb. 4: Vergleich von Blue LAMP und RT-PCR hinsichtlich der Eignung des Pflanzenextrakts als Template, gewonnen aus Pflaumen-Genotypen während der Resistenzprüfung

Die durch das Plum pox virus verursachte Scharka-Krankheit führt zu enormen wirtschaftlichen Schäden im Steinobstanbau. Zur Verhinderung der Virusausbreitung ist eine zuverlässige Diagnose erforderlich. Etablierte Verfahren zum Nachweis des Virus sind jedoch zeit-, arbeits- und kostenintensiv. Mit Hilfe der neu entwickelten, sensitiven Blue LAMP Methode kann die PPV RNA mit geringem technischem Aufwand innerhalb weniger Stunden detektiert werden. Phytopathogene werden bisher über Indikatorpflanzen, ELISA oder RTPCR nachgewiesen.

Diese Verfahren sind zum Teil langwierig, kostenintensiv, arbeitsaufwändig und/oder erfordern eine teure Laborausstattung. Um Hochdurchsatz- und Vor- Ort-Analysen zu ermöglichen, wurde am Fachgebiet Obstbau der Technischen Universität München für das Plum pox virus (PPV) ein neues Nachweisverfahren etabliert.

Die Scharka-Krankheit

Die Krankheit tritt vor allem an europäischer und japanischer Pflaume, Pfirsich und Aprikose auf und ist in fast allen bedeutenden Steinobstanbaugebieten der Welt zu finden. Typische Symptome (Abb. 1) zeigen sich durch ringförmige Chlorosen auf Blättern und Früchten, welche vorzeitig ausfärben und abfallen. Früchte sind zudem durch Einsenkungen missgestaltet. Die Schäden setzen sich im Fruchtfleisch fort, weshalb die Früchte weder für den Frischverzehr noch für die Verarbeitung verwendet werden können.

Befallene Bäume müssen gerodet werden, da eine Gesundung nicht möglich ist und eine Verbreitung vermieden werden muss. Sowohl Ertragsausfälle als auch Neupflanzungen verursachen hohe finanzielle Belastungen. Ausgelöst wird Scharka durch das PPV, dessen Genom als einzelsträngige RNA vorliegt. PPV wird durch Blattläuse aber auch durch Vermehrung von infiziertem Pflanzenmaterial verbreitet.

Schutz vor einer Infektion bietet nur die Hypersensibilitätsresistenz, die zum Absterben infizierter Zellen führt und somit die Replikation und Ausbreitung des Virus verhindert. Im Rahmen des Pflaumenzüchtungsprogramms am FG Obstbau wird die Resistenz in neue Genotypen eingekreuzt. Diese werden selektiert zur Verwendung als Sorten oder Unterlagen im Obstanbau.

Das Blue LAMP Protokoll

Ebenso wie die PCR dient die Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) zur gezielten DNA-Amplifikation, läuft aber bei einer konstanten Temperatur zwischen 60 und 65 °C ab [1].

Sie beruht auf der Verwendung einer DNA Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität und vier Primern, die sechs spezifische Bereiche erfassen [2]. Die Primer FIP (forward inner primer) und BIP (backward inner primer) enthalten sowohl am 3‘-Ende eine zum Target komplementäre (F2/B2) als auch am 5‘-Ende eine homologe Sequenz (F1c/B1c; Abb. 3A).

Sie binden in einem Bereich, der von den Primern F3 und B3 umschlossen wird. Nach Annealing von B3 und BIP (Abb. 3B) werden diese durch die Polymerase verlängert, wobei der durch BIP initiierte Strang durch die bei B3 gestartete Polymerase abgeschoben wird (Abb. 3C). Durch die 5‘ Sequenz des BIP kommt es zur Schleifenbildung innerhalb des abgeschobenen DNA Strangs, der gleichzeitig als Templat für F3 und FIP dient (Abb. 3D).

Der hierbei verdrängte Strang besitzt an beiden Enden Schleifen und bildet das Ausgangsmaterial für die eigentliche Amplifikation (Abb. 3E). Die DNA Synthese beginnt einerseits am freien 3‘-Ende der Schleife als auch am BIP, der wiederum an diese Schleife bindet (Abb. 3F). Die Polymerase verdrängt den die Schleife verlängernden DNA Strang (Abb. 3G).

Es kommt zur Ausbildung einer Schleife an diesem DNA Einzelstrang und zu deren Elongation. Über FIP wird ebenfalls die DNA Synthese initiiert und somit der gebundene DNA Strang abgeschoben (Abb. 3H). Durch die wechselseitige Verlängerung der Schleifen und der internen Primer wird das ursprüngliche DNA Molekül kontinuierlich verlängert.

Zusätzlich werden DNA Stränge abgespalten, die ebenfalls in die Amplifikation eingehen (Abb. 3I). Durch diesen Mechanismus wird die Notwendigkeit für eine thermische Denaturierung vermieden. Anstelle eines Thermozyklers wird daher nur ein Heizblock benötigt. Durch Zugabe einer reversen Transkriptase kann mit dieser Methode RNA direkt erfasst werden (RT-LAMP), wie es bei PPV der Fall ist [3].

Der Einsatz weiterer, sogenannter Loop-Primer beschleunigt die Reaktion. Diese binden an die Schleifen, die nicht von internen Primern belegt sind [4]. Die Auftrennung der Amplifikate mittels Gelelektrophorese führt zu zahlreichen Banden, die ein leiterähnliches Muster ergeben und dadurch die unterschiedlichen Längen der DNA Moleküle widerspiegeln (Abb. 2).

Neben den isothermalen Reaktionsbedingungen ist eine weitere Besonderheit der LAMP ihre sehr hohe Amplifikationsrate. Das entstehende Pyrophosphat bildet mit den im Puffer enthaltenen Magnesiumionen ein Präzipitat. Durch Hydroxynaphtholblau, einem Metallionenindikator, kann die sinkende Magnesiumkonzentration durch Farbumschlag von violett nach blau angezeigt werden (Abb. 4) [5].

Dies zeigt indirekt die DNA Amplifikation an, wodurch auf die Gelelektrophorese verzichtet werden kann, was den Arbeits- und Zeitaufwand reduziert. Hoher Aufwand muss für die Aufreinigung von Nukleinsäuren zur Verwendung in PCR und RT-PCR betrieben werden. Da die LAMP im Vergleich zur PCR äußerst unempfindlich gegenüber im Probenmaterial vorhandene Inhibitoren ist, kann auch die Aufbereitung der Proben vereinfacht werden [6]. Unabhängig von der Art der Probe (Blatt, Knospen, Rinde, Blüte, Frucht) werden diese in Wasser homogenisiert, zentrifugiert, verdünnt und direkt in die Blue LAMP eingesetzt (Abb. 4).

Nachweis von PPV

Die Verwendung der Blue LAMP zur Detektion des Scharka-Virus reduziert die Dauer von der Probennahme bis zum Ergebnis auf zwei Stunden im Vergleich zur RT-PCR, für die mit RNAAufreinigung bis zu sechs Stunden benötigt werden. Durch die vereinfachte Probenaufbereitung und der Kombination von reverser Transkription von PPV-RNA, DNA Amplifikation und deren Visualisierung in einem Reaktionsgefäß werden zudem die notwendigen Arbeitsschritte reduziert, was auch das Risiko von Kreuzkontaminationen minimiert. Trotzdem liegt die Nachweisgrenze auf dem gleichen Niveau wie die der RT-PCR und somit weit unterhalb der des ELISA Tests [7].

Fazit

Das Blue LAMP Verfahren stellt gerade im Bereich der Diagnostik eine einfache, verlässliche, schnelle und preiswerte Alternative zur PCR im Obstbau, im Gartenbau und in der Landwirtschaft dar, die sich nicht nur für einzelne Proben eignet, sondern auch für Hoch durchsatz-Analysen. Ähnlich zur in der Humanmedizin vermehrt eingesetzten patientennahen Labordiagnostik ermöglicht die Blue LAMP den Nachweis von PPV nicht nur Forschungseinrichtungen und Landwirtschaftsämtern sondern auch Genossenschaften, Obstbauern und Baumschulen, welche somit selbstständig ihre Anlagen überwachen und Pflanzenmaterial bereits bei Lieferung bzw. vor Auslieferung auf Virusbefall testen können.

Dies erlaubt zum einen eine wesentlich schnellere Reaktion auf das Auftreten von PPV in der Obstanlage, zum anderen wird die Verbreitung des Virus durch Handelsware unterbunden. Derzeit wird das Verfahren an weitere obstbaulich relevante Phytopathogene angepasst, wie Candidatus Phytoplasma pyri und Erwinia amylovora, die ursächlich sind für Birnenverfall und Feuerbrand bei Apfel und Birne

Danksagung

Die Förderung des Vorhabens erfolgte aus Mitteln des Bundesministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV) im Rahmen des Programms zur Innovationsförderung. Literatur bei den Autoren erhältlich.

 

Autor(en)

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Technische Universität München - FG Obstbau
Alte Akademie 8
85354 Freising

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