Laser-Ringe, Lichtblätter und „Big Data“

Wohin gehen die Entwicklungen in der modernen Lichtmikroskopie?

  • Abb. 2: Mit adaptiver Optik erstelltes tiefenkodiertes 3D STORM Bild von mit AlexaFluor 647 angefärbten Mikrotubuli einer Zelle. Laterale Auflösung ca. 40 nm, axiale Auflösung ca. 90 nm. Bild von Thomas Pengo (CRG, Barcelona).Abb. 2: Mit adaptiver Optik erstelltes tiefenkodiertes 3D STORM Bild von mit AlexaFluor 647 angefärbten Mikrotubuli einer Zelle. Laterale Auflösung ca. 40 nm, axiale Auflösung ca. 90 nm. Bild von Thomas Pengo (CRG, Barcelona).
  • Abb. 2: Mit adaptiver Optik erstelltes tiefenkodiertes 3D STORM Bild von mit AlexaFluor 647 angefärbten Mikrotubuli einer Zelle. Laterale Auflösung ca. 40 nm, axiale Auflösung ca. 90 nm. Bild von Thomas Pengo (CRG, Barcelona).
  • Abb. 3: Mittels Lightsheet Mikroskopie erstelltes Projektionsbild eines Maus-Embryos mit zwei Antikörperfärbungen. Cyan: Neurofilament, Magenta: E-Cadherin. Bild von Jim Swoger (CRG, Barcelona).“
  • Abb. 1: Konfokale und 3D STED Aufnahme eines marinen Einzellers (Dinoflagellata) mit 200 optischen Schnitten. Das Tubulin-Zytoskelett wurde mit einem a-Tubulin Antikörper und Oregon Green markiert. Dargestellt sind die Aufsicht und Seitenansicht als Projektionen des konfokalen Datensatzes, der STED Rohdaten und der mit Dekonvolution nachbearbeiteten STED Daten. Dinoflagellatenprobe von Elisa Berdalet (CSIC-ICM, Barcelona)
  • Abb. 4: Mit Lightsheet Mikroskopie erstellte Aufnahme des sich entwickelnden Innenohrs eines Zebrafisch-Embryos. Datensatz mit 500 optischen Schnitten, von denen hier ca. 200 als Projektion zusammengefasst wurden. Grün: Sinneszellen des Innenohrs, Rot: Zellgrenzen, Blau: Nuklei (Histone) Bild von Sylvia Dyballa, Universitat Pompeu Fabra, Barcelona
  • Dr. Timo Zimmermann ist seit 2007 der Leiter der Advanced Light Microscopy Unit des Center for Genomic Regulation in Barcelona.

Die Lichtmikroskopie ist eine für viele naturwissenschaftliche Forschungsbereiche grundlegende Technologie, die durch viele neue Entwicklungen in den letzten Jahrzehnten eine regelrechte Renaissance erlebt und sich seitdem zu einen intensiv bearbeiteten Entwicklungsbereich gewandelt hat. Fortschritte in der Detektortechnologie, die Überwindung der Beugungsgrenze in der Mikroskopie und eine Neuanordnung der mikroskopischen Beleuchtung in Form eines Lichtblatts ermöglichen neuartige Einblicke in den Mikrokosmos und stellen uns gleichzeitig vor neue Herausforderungen in der Handhabung der Datenmengen.

Seit langem sind mikroskopische Techniken aus den meisten Bereichen der Naturwissenschaften nicht mehr wegzudenken. Sei es in den Materialwissenschaften oder in den Feldern der Medizin und Biologie, bildgebende Verfahren der Mikroskopie kommen überall zum Einsatz. Und obwohl Mikroskope, wie auch die in der Astronomie verwendeten Fernrohre, ursprünglich für die direkte Betrachtung mit dem Auge entwickelt wurden und somit auf den Bereich des sichtbaren Lichts beschränkt waren, wurden in den letzten hundert Jahren weitere Bereiche des Spektrums für die Bildgebung erschlossen und die Erkenntnisse der geometrischen bzw. Strahlenoptik auch auf Elektronen- und Ionenstrahlen angewandt. Rastermethoden schließlich, wie sie z.B. in der Rasterkraft- und auch der Nahfeldmikroskopie zum Einsatz kommen, entkoppeln die Mikroskopie gänzlich von den durch die Optik gegebenen Grenzen. Bei einem so stark erweiterten Feld an Detektionsmöglichkeiten und in Anbetracht der Tatsache, dass es Lichtmikroskope schon länger gibt als die Newtonschen Gesetze der Physik, kann die Frage erlaubt sein, was es in der Lichtmikroskopie noch Neues geben kann. Dieser Frage will ich mich im Folgenden widmen.

Ein Zusammenspiel vieler Faktoren (Computer, CCD Kameras, Laserlichtquellen, Fluoreszenzfärbungen) hat schon in den letzten 30 Jahren das Repertoire der Lichtmikroskopie grundlegend erneuert und es zu einem der sich am dynamischsten entwickelnden Wissenschaftsfelder überhaupt gemacht. In diesen Jahren wurden die konfokale Laserscanning Mikroskopie, Zwei Photonen Mikroskopie, Dekonvolutionsmikroskopie und die Total Internal Reflection Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie etabliert.

Vor allem Verbesserungen in der Kamera- und Detektionstechnik sorgen dafür, dass alle diese Bereiche der Lichtmikroskopie sich stetig weiterentwickeln. Neue Formen der Höchstauflösungsmikrosopie sowie die Lightsheet Mikroskopie sollen in den nächsten Abschnitten genauer dargestellt werden.

Mikroskopie jenseits der Auflösungsgrenze
Die Definition des maximalen Auflösungsvermögens eines Mikroskops, entsprechend der Lichtbeugung durch Ernst Abbe im Jahre 1873, war ein essentieller Beitrag zum Verständnis der Optik von Mikroskopen, der auch heute noch seine Gültigkeit hat. Das Bewusstsein über die Existenz einer fundamentalen Obergrenze der optischen Auflösung durch die benutzte Wellenlänge und den Erfassungswinkel der verwendeten Optik, hat sich in den darauf folgenden Jahrzehnten jedoch auch zu einem Hemmschuh im Nachdenken über höher auflösende Methoden entwickelt, der erst in jüngster Zeit abgelegt werden konnte. Dass auch die seither vorgestellten Ansätze erst im engen Zusammenspiel der oben beschriebenen Entwicklungen in der Lichtmikroskopie und Färbetechnik der letzten 30 Jahre möglich wurden, erklärt den langen Bestand von Ernst Abbes Beugungsgrenze und verdeutlicht ihre Wichtigkeit. Die Überwindung dieser Grenze wiederum öffnet den Zugang zu völlig neuen Erkenntnissen und ermöglicht einen noch besseren Brückenschlag zwischen der (hochspezifischen) Lichtmikroskopie und der strukturell hochauflösenden Elektronenmikroskopie.

1) 4Pi Mikroskopie
Ein erster Ansatz für Auflösungserhöhung wurde vor zwei Jahrzehnten durch die Nutzung von Interferenzeffekten zwischen auf beiden Seiten einer Probe positionierten Objektiven umgesetzt (4Pi Mikroskopie, I5Mikroskopie). Die Auflösungsverbesserung beschränkte sich hierbei auf die z-Achse der Probe, sodass die erreichte Auflösung in Z deutlich höher als in der Probenaufsicht (XY) sein konnte. Wegen dieser auf eine Achse begrenzten Verbesserung, der Notwendigkeit einer exakten Kalibrierung der gegenüberliegenden Objektive und auch optischen Artefakten, die erst durch Nachbearbeitung beseitigt werden konnten, blieb dieser Ansatz letztendlich auf Spezialanwendungen beschränkt.
In den folgenden Jahren wurden drei weitere Ansätze zur Darstellung von Strukturen jenseits der Auflösungsgrenze entwickelt, die inzwischen in vielen Laboratorien weltweit angewendet werden.

2) Strukturierte Beleuchtung
Strukturierte Beleuchtung (d.h. die Überlagerung des Bildbereichs mit einem feinen Gittermuster) führt zur Entstehung von Moiré-Mustern, die sich aus der Wechselwirkung des Probenbildes mit dem überlagerten Anregungsgitter bilden. Wird diese Gitterbeleuchtung systematisch über den Bildbereich bewegt und wird dieser Vorgang mit verschiedenen Orientierungen des Musters wiederholt, lassen sich die so erhaltenen Bilder zu einer Abbildung verrechnen, deren Auflösung doppelt so hoch ist wie die der Ausgangsbilder. Im Gegensatz zu den anderen beiden entwickelten Methoden, unterscheidet sich die Technik der strukturierten Beleuchtung nicht grundlegend von der normalen Fluoreszenzmikroskopie und lässt sich damit mit allen Fluoreszenzfarbstoffen verwenden, solange eine geeignete Anregung und Detektionskonfiguration vorhanden ist. Durch die Verwendung von Lasern und der Notwendigkeit, das Gitter exakt im Bild zu positionieren und zu verschieben, sind jedoch auch diese Mikroskope sehr komplexe Instrumente.

3) STED Mikroskopie
Stimulierte Emission, wie sie in der Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie verwendet wird, basiert auf dem gleichen Prinzip, welches das Licht im Laser (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation) erzeugt. Die intensive Bestrahlung eines Fluorophors, in schon angeregtem Zustand mit Licht und in einer Wellenlänge im Emissionsspektrum dieses Fluorophors, führt dazu, dass das Fluorophor ein Photon derselben Wellenlänge emittiert und dabei in den Grundzustand zurückkehrt. Im Laser führt dieses Phänomen zur gezielten Lichtvermehrung in der stimulierten Wellenlänge. In der STED Mikroskopie wird die auf diese Weise kontrollierte Abstrahlung dazu verwendet, Fluorophore gezielt „abzudunkeln" und für die Detektion unsichtbar zu machen, indem die Emission in einer Wellenlänge ausserhalb des gewählten spektralen Detektionsbereichs „erzwungen" wird. Nachdem er das Konzept schon einige Jahre vorher postuliert hatte, konnten Stefan Hell und seine Mitarbeiter um das Jahr 2000 Mikroskope mit einem konfokalen Lichtweg bauen, die einen Fluoreszenzanregungsstrahl mit einem starken, für stimulierte Emission verwendeten Lichtstrahl (Depletionsstrahl), geschickt überlagerten [1]. Dies erlaubte es die Abbesche Beugungsgrenze zu überwinden, indem sich zwei weiterhin beugungslimitierte Strahlen (Anregungs- und Depletionsstrahl) so überlagern, dass es nur noch in einem viel kleineren als durch Beugung gegebenen Raum zur Detektion von Fluoreszenz kommen kann. Die Abrasterung des mikroksopischen Bildbereichs geschieht dabei wie in einem konventionellen Konfokalmikroskop aber mit einer Auflösung weit unter der Beugungsgrenze. Die Größe des verbleibenden Anregungsvolumens ist hierbei von der Intensität des Depletionsstrahls abhängig.

In STED Mikroskopsystemen werden sehr starke Laser verwendet, um Fluoreszenz außerhalb des gewünschten Detektionsbereichs komplett zu unterbinden (saturierte Depletion). Obwohl das zugrundeliegende Prinzip allgemein anwendbar ist, funktioniert STED Mikroskopie am besten mit dafür geeigneten Fluorophoren, die sich effzient depletieren lassen und dabei nicht durch die hohe Intensität des verwendeten Depletionslichts beschädigt werden. Nachdem der STED Effekt längere Zeit hauptsächlich für die Erhöhung der lateralen Bildauflösung genutzt wurde, kam Anfang 2014 ein System (Leica TCS SP8 STED 3X) auf den Markt, dass die Auflösung in allen drei Dimensionen erhöht (s. Abb. 1) und in dem zwei Laser für die Depletion in unterschiedlichen spektralen Bereichen verwendet werden können.

4) Lokalisationsmikroskopie
Der letzte Ansatz zur Überwindung der optischen Auflösung eines Lichtmikroskops basiert auf der Tatsache, dass die Position eines Objektes unterhalb der Auflösungsgrenze auch anhand seiner beugungsbegrenzten Darstellung (Airy-Scheibe) mit einer vielfach größeren Genauigkeit ermittelt werden kann, als das Objekt selbst dabei aufgelöst wird. Die Notwendigkeit, dabei einzelne Moleküle gegen einen minimalen Hintergrund zu detektieren, macht es jedoch zunächst unmöglich, diesen Ansatz für normale Fluoreszenzbilder zu verwenden, da die hohe Konzentration an Fluorophoren dies verhindert. Die Einführung von photoaktivierbaren Molekülen ermöglichte es, diese Limitation zu umgehen, und durch graduelle Aktivierung von jeweils nur wenigen Mölekülen gleichzeitig, diese auch in Proben mit hohen Färbekonzentrationen genau zu orten. Nachdem die nötigen Komponenten (gezielt anschaltbare Fluorophore und empfindliche schnelle Kameras) verfügbar waren, wurde die Methode im Jahr 2006 fast gleichzeitig von drei voneinander unabhängigen Forschergruppen entwickelt, als Photoactivation Localization Microscopy (PALM) [2] für fluoreszierende Proteine und Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) für in der Immunfluoreszenz verwendete Moleküle (hier anfänglich mit gekoppelten Aktivator-Emitter Kombinationen [3] und später auch direkt mit einzelnen Fluorophoren [4]). Für die Erstellung eines mikroskopischen Bildes mittels Lokalisationsmikroskopie werden Tausende von Aktivierungszyklen benötigt, in denen jeweils nur ein paar zufällig verteilte Fluorophore in jedem Bild sichtbar sind. Aus der kompletten Bildserie mit „blinkenden" Lichtpunkten werden dann für jedes Bild die exakten Koordinaten der einzelnen Fluorophore ermittelt. Die Liste der Koordinaten kann schließlich zu einem Bild verarbeitet werden, dessen Auflösung unter 30 nm liegt und somit die optische Auflösung um das bis zu Zehnfache übersteigt. Durch Nutzung der in den Beugungsmustern einzelner Objekte enthaltenen z-Information können PALM und STORM Methoden auch für eine hochaufgelöste dreidimensionale Darstellung der Strukturen im Bild verwendet werden (Abb. 2).

Um den Hintergrund für die Einzelmoleküldetektion so niedrig wie möglich zu halten, werden Beleuchtungswinkel unter oder leicht über dem für Totalreflektion nötigen Winkel verwendet. Dies schränkt die Anwendbarkeit der Technik für dickere Proben ein, obwohl inzwischen Abwandlungen der Lokalisationsmikroskopie für solche Proben entwickelt wurden. Die für die Bildberechnung nötige Erstellung tausender Einzelaufnahmen führt dazu, dass die Aufnahmedauer im Minutenbereich liegt und sich somit nicht für die Darstellung dynamischer Prozesse eignet. Die Rohdatenmenge für eine Lokalisationsmessung liegt im Gigabyte-Bereich.

Die drei in den letzten Jahren entwickelten Ansätze erscheinen sehr unterschiedlich, sie haben jedoch auch große Gemeinsamkeiten und können sich sogar ergänzen. STED basiert auf einer sehr spezifischen Eigenschaft von Fluorophoren, der stimulierten Emission. Die Überlagerung eines An- und Abschaltstrahls, wie sie momentan für STED praktiziert wird, lässt sich jedoch auch mit schaltbaren Molekülen verwenden, sodass diese beide Anwendungen als zwei Aspekte eines generelleren Ansatzes (REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions, RESOLFT) betrachtet werden können. RESOLFT wiederum lässt sich nicht nur als Rasterstrahlverfahren, sondern auch in strukturierter Beleuchtung anwenden. Alle Ansätze können sich also gegenseitig befruchten. Notwendig sind hierfür sehr schnell und vielfach hintereinander schaltbare Fluorophore, was die bisherige Nutzung eingeschränkt hat. Es hat in letzter Zeit jedoch vielversprechende Entwicklungen in dieser Richtung gegeben [5]. Idealerweise lassen sich die oben beschriebenen Methoden damit sogar auf eine weitere vor kurzem entwickelte Methode, die Lightsheet Mikroskopie, ausweiten.

Mikroskopie im rechten Winkel
Aus dem Bereich der Mehrfachobjektivnutzung heraus entwickelte sich in den letzten Jahren ein Mikroskopkonzept [6], das sowohl durch seine Möglichkeiten als auch durch seine Einfachheit besticht. Es ist deswegen nicht erstaunlich, dass ein Nobelpreis dafür schon vor fast hundert Jahren vergeben wurde (Richard Zsigmondy, 1925). Das von ihm für die Kolloidforschung entwickelte Ultramikroskop hat große Ähnlichkeit mit den modernen Lightsheet Mikroskopen, in denen ein mit einer Zylinderlinse erzeugtes „Lichtblatt" die Probe im rechten Winkel zu einem Detektionsobjektiv beleuchtet. Diese Anordnung ist sehr effizient, da durch die selektive Beleuchtung einer einzelnen Ebene der Probe ein optischer Schnitt entsteht, der direkt mit einer Kamera aufgenommen werden kann. Durch die direkte Schnittabbildung ohne die Notwendigkeit einer Bildrasterung ist die Lightsheet Mikroskopie sehr schnell und kann in kurzer Zeit große Probenvolumina aufnehmen. Da die Beleuchtung nur in der Bildebene stattfindet, wird das Bleichen und die Beschädigung der Probe durch das Anregungslicht weitestgehend minimiert. Das Einbringen der Proben in die mit Flüssigkeit gefüllte Aufnahmekammer geschieht meistens hängend und eignet sich damit eher für größere Organismen als für einzelne Zellen (Abb. 3). Aufgrund der Schnelligkeit und der Kompatibiliät mit großen lebenden Proben (flüssigkeitsgefüllte Probenkammer, minimale Beleuchtung, Aufhängung) wird Lightsheet Mikroskopie oft für die Erstellung von langen 3D Zeitserien von ganzen Organismen verwendet. Da es in größeren Proben zu Abschattungen im Lichtblatt kommen kann, werden in manchen Instrumenten mehrere komplementäre Lichtwege verwendet, sodass abwechselnd genutzte Beleuchtungs- und Detektionskonfigurationen die Probe in ihrer Gesamtheit erfassen. Die dabei entstehenden Datenmengen befinden sich im Bereich von vielen Gigabytes und stellen zusammen mit den neuen Hochauflösungsmikroskopiemethoden neue Herausforderungen für die Speicherung und auch die Visualisierung und weitergehende Analyse solcher Datensätze. Ansätze zur kreativen Datenkompression, wie z.B. die Erstellung von Panoramabildern der Oberflächen von mit Lightsheet Mikroskopie aufgenommenen Zebrafisch Embryonen [7] werden wichtig sein, um das Potential der neuen Techniken richtig zu nutzen.

Literatur
[1] Klar T. A. et al.: Proc Natl Acad Sci U S A 97, 8206-8210 (2000)
[2] Betzig E. et al.: Science 313, 1642-1645 (2006)
[3] Rust M. J. et al.: Nat Methods 3, 793-795 (2006)
[4] van de Linde S.: Nat Protoc 6, 991-1009 (2011)
[5] Grotjohann T. et al.: Nature 478, 204-208 (2011)
[6] Huisken J. et al.: Science 305, 1007-1009 (2004)
[7] Schmid B. et al.: Nat Commun 4, 2207 (2013)

Weitere Beiträge zum Thema: http://bit.ly/Mikroskopie
Moiré Effekt: http://bit.ly/GIT-Moiree
Stefan Hell erklärt Superresolution Mikroskopie und STED: http://bit.ly/Hell-STED
Webcast zur STED Mikroskopie: http://bit.ly/GIT-STED

Lebenslauf Dr. Timo Zimmermann
Dr. Timo Zimmermann ist seit 2007 der Leiter der Advanced Light Microscopy Unit des Center for Genomic Regulation in Barcelona. Nach dem Studium der Biologie in München und der anschließenden Promotion über Zell- und Entwickelungsbiologie am Konfokalmikroskop arbeitete er mehrere Jahre in der Advanced Light Microscopy Facility des Europäischen Molekularbiologielaboratoriums in Heidelberg, bevor er die Lichtmikroskopie-Einheit am neu geschaffenen Institut in Barcelona einrichtete.

 

Autor(en)

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