Lichtblättern im transparenten Gehirn

Lebenslauf von Luke Harrison: Luke Harrison arbeitet seit 3 Jahren am Helmholtz Zentrum München in der Arbeitsgruppe von Dr. Paul Pfluger. Er verfasst dort seine Doktorarbeit über neuartige Krankheitsentitäten und Behandlungsstrategien für Leptinresistenz und das metabolische Syndrom. Den ersten Kontakt mit Mikroskopie bekam er während seines Biologiestudiums in Edinburgh, Schottland, und im Zuge eines Praktikums beim Mikroskop-Hersteller Till Photonics. Sein Masterstudium absolvierte er in 2015 an der Ludwig-Maximilians-Universität München in Biologie mit dem Schwerpunkt auf moderne Mikroskopieverfahren zur Visualisierung von Immunzellen. Von Beginn an interessierte er sich für die Verwendung von innovativen Mikroskopiemethoden, um biologische Fragestellungen zu beantworten.
Lebenslauf von Paul Pfluger: Dr. Paul Pfluger leitet seit 4 Jahren die Abteilung Neurobiologie des Diabetes am Helmholtz Zentrum München. Nach dem Studium der Biologie an der Universität Konstanz und der Promotion zur Biochemie von Mikronährstoffen am Deutschen Institut für Ernährungsforschung in Potsdam-Rebrücke beschäftigt er sich seit einem langjährigen Forschungsaufenthalt als Postdoc sowie Assistenzprofessor an der University of Cincinnati in den USA mit zentralnervösen Mechanismen der Energie- und Glukosehomöostase. Aktuell arbeitet sein Team an der Erforschung der hypothalamischen Leptin-Resistenz sowie an epigenetischen Mechanismen des Jojo-Effektes nach Gewichtsverlust.
Abb. 1: Markiertes Leptin in Kombination mit Tissue‑Clearing und Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die 3D-Darstellung der Leptinverteilung im intakten Mausgehirn. Nach Injektion von markiertem Leptin in dünne oder adipöse Mäuse wurden 45 min später die Gehirne entnommen und mittels Tissue‑Clearing transparent gemacht und hiermit für die Lichtblattmikroskopie vorbereitet (A). Die Akkumulation von fluoreszenzmarkiertem Leptin in den Plex –us choroides sowie weiteren zirkumventrikulären Organen wird sowohl in der koronalen (B) als auch in der orthogonalen Betrachtungsebene (C) sichtbar. Das Gehirngefäßsystem wird rot dargestellt, Leptin erscheint in grün. Das noch im Kreislauf befindliche Leptin wird aufgrund der Überlappung von Rot und Grün als orange / gelb wahrgenommen. Der Vergleich vor und nach Tissue‑Clearing am Gehirn wurde aus Chung et al. Nature (2013) 497, 332–337 2013 adaptiert.
Abb. 2: Vergleich von Lichtblatt- und traditioneller Weitfeldbeleuchtung. (a) Darstellung einer planaren Lichtblattbeleuchtung. (b) Typische Weitfeldbeleuchtung mit deutlicher Beleuchtung außerhalb der Fokusebene. (c) Nur ein dünner Abschnitt der Probe wird bestrahlt. (d) Durch Weitfeldbeleuchtung wird ein viel größeres Probenvolumen bestrahlt, das meiste davon ist unscharf. Die Abbildung wurde adaptiert aus John R. Allen - microscopyu.com/techniques/light-sheet/light-sheet-fluorescence-microscopy (Nikon Instruments Inc., 1300 Walt Whitman Road, Melville NY 11747-3064)

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Adipöse Patienten fühlen sich nach einer Mahlzeit oft nicht satt, obwohl sie genügend Kalorien konsumiert haben. Diese Störung im Sättigungsverhalten adipöser Menschen wird oft mit der fehlenden Wirkung des Sättigungshormons Leptin in Verbindung gebracht. Dieses vom weißen Fettgewebe sezernierte Hormon ist ein wichtiger Regulator unserer Nahrungsaufnahme und unseres Körpergewichtes. Die Plasmakonzentrationen von Leptin stehen in engem Zusammenhang mit der Menge der Fettspeicher im Körper. Je mehr Fett vorhanden ist, desto höher ist die Leptin Konzentration im Blut und desto mehr Leptin gelangt über die Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn. Im Gehirn erreicht Leptin die Sättigungszentren und bindet an den Leptinrezeptor, der von bestimmten neuronalen Populationen exprimiert wird. Diese aktivierten Neuronen signalisieren dem Rest des Gehirns, den Verzehr von Nahrungsmitteln einzustellen. Wenn diese Gehirnregionen trotz hoher Leptin-Konzentrationen nicht aktiviert werden, spricht man von Leptinresistenz. Das Ergebnis ist ein ständiges Hungergefühl, als wären die Energiespeicher im Körper aufgebraucht. Leptinresistenz gilt als eine der Hauptursachen für Fettleibigkeit. Bisher wurde angenommen, dass ein fehlender oder reduzierter Transport über die Blut-Hirn-Schranke die Ursache für die Leptinresistenz ist. Dies würde dazu führen, dass nicht genug Leptin die für die Sättigung wichtigen Hirnregionen erreicht. Mit unserem neuartigen 3D-Visualisierungsverfahren konnten wir zum ersten Mal Leptin sichtbar machen und testen, ob diese Theorie stimmt.

Die dritte Dimension

Um biologische Vorgänge besser verstehen zu können, ist es oft von Vorteil, sich von traditionellen 2-dimensionalen Darstellungsmethoden zu entfernen. Biologische Proben sind inhärent dreidimensional, die Betrachtung in 2D kann also dazu führen, dass die Perspektive verloren geht und wertvolle Informationen übersehen werden. Durch die Kombination von Tissue‑Clearing, Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie und fluoreszierender Proteinmarkierung konnte diese 3. Dimension eröffnet werden und neue Einblicke in den Transport und die Akkumulation von Leptin im 3-dimensionalen Mäusehirn gewonnen werden.

Tissue-Clearing

Das Tissue-Clearing (Transparentmachung von Gewebe) ist eine Methode, die sich schon seit dem frühen 20.

Jahrhundert in der Literatur findet [1], jedoch erst rund 100 Jahre später an Bedeutung gewinnen konnte. Eine der häufigsten Hürden bei der Fluoreszenzabbildung in biologischen Geweben ist die Streuung von Licht. Dies geschieht aufgrund der unterschiedlichen Brechungsindizes zwischen den Strukturen in den Zellen, beispielsweise einer Lipidmembran und dem Zytosol. Es gibt verschiedene Clearing Techniken mit jeweils unterschiedlichen Vor- und Nachteilen. Im vorliegenden Fall wurde die lösungsmittelbasierte Clearing Methode angewendet. Diese dauert in der Regel 1 Woche und umfasst zwei Schritte: 1. Dehydratisierung mit Lipidsolvatisierung durch typische Alkoholdehydratisierung und 2. zusätzliche Lipidsolvatisierung und Clearing durch Brechungsindexanpassung an den verbleibenden Index des dehydratisierten Gewebes unter Verwendung einer Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat. Die Reduktion von Lichtstreuungen sind schon mit bloßem Auge eindeutig zu erkennen (Abb. 1a)

Wie klar ist klar genug?

In den letzten Jahren hat das Tissue-Clearing viel Aufmerksamkeit in der wissenschaftlichen Gemeinschaft gefunden, da dessen Vorteile immer deutlicher werden. Mittlerweile gibt es eine Vielzahl von Clearing‑Möglichkeiten, die entweder von gewerblichen Anbietern in Form von Kits angeboten werden oder relativ einfach im Labor selbst durchgeführt werden können. Bei der Entscheidung, welche Clearing-Methode am besten geeignet ist, konzentrieren sich die Faktoren auf Zeit, Immunfärbungsmöglichkeiten, endogene Fluoreszenzsignalretention, morphologische Veränderung und Lipidkonservierung. Derzeit gängige Clearing-Verfahren fallen hauptsächlich in vier Kategorien: lösungsmittelbasierte Clearing-Techniken, Clearing-Verfahren für wässrige Lösungen mit hohem Brechungsindex, hyperhydratisierende Clearing-Techniken und Hydrogel-basierte Methoden.

1) Lösungsmittel-basierte Clearing-Techniken

Die Hauptvorteile lösungsmittelbasierter Clearing-Verfahren sind die Qualität und die Geschwindigkeit des Clearings. Die Geschwindigkeit wird besonders interessant, wenn das Clearing mit einer Immunfärbung kombiniert wird, da das Eindringen von Antikörpern in große Gewebe sehr lange dauern kann, normalerweise mehrere Wochen (obwohl neue Methoden diese Zeitbegrenzung überwinden, wie wir weiter unten darlegen). Aus diesem Grund ist ein schnelles Clearing kritisch, wenn die Versuchsdauer innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens gehalten werden soll. Einer der Hauptnachteile bei lösungsmittelbasierten Verfahren ist die toxische und ätzende Wirkung der verwendeten Chemikalien. Hierdurch sind spezielle Werkzeuge und Objektive erforderlich, um Schäden am Mikroskop zu vermeiden. Zudem sind keine direkten Lipidfärbungen möglich, da Lipide chemisch entfernt wurden. Da außerdem das Gesamtgewebe während des Clearing-Prozesses schrumpft, kann die Gewebemorphologie gravierend modifiziert sein. Die meisten Clearing-Ansätze basieren auf der Verwendung von Benzylalkohol und Benzylbenzoat (BABB) als Grundlösungsmittel. Das ursprüngliche BABB-Protokoll quencht jedoch die Fluoreszenzemission nach kurzer Zeit und ist daher für viele mikroskopische Analysen nicht geeignet [2]. Protokollanpassungen wie 3DISCO [3] sorgen hier für eine verbesserte Fluoreszenzstabilität. Diese Protokolle werden ständig verbessert, was man an den Beispielen von uDISCO [4] und vDISCO [5] deutlich erkennen kann. Um endogene Fluoreszenz trotz BABB-basiertem Clearing zu erhalten, wurde zudem ein neues Verfahren entwickelt das auf dem Einbetten von geclearten Geweben in klare feste Harze basiert, wodurch letztendlich die Photobleichung drastisch verringert wird [6].

2) Wässrige Reinigung mit hohem Brechungsindex

Diese Methoden sind relativ einfach durchführbar und verwenden häufig nicht-toxische Substanzen wie Saccharoselösungen oder 2,2‘-Thiodiethanol (TDE), wodurch sie für eine Vielzahl von Mikroskopsystemen und Laboren geeignet sind. Ein weiterer großer Vorteil ist die Lipidkonservierung, d.h. Lipide können direkt angefärbt werden. Ein großer Nachteil ist jedoch die Clearing-Zeit, die normalerweise im Bereich von einigen Wochen liegen wird. Dementsprechend dauert das Clearing größerer Gewebe noch länger und ist mit dieser Methode oft nicht realistisch.

3) Hyperhydratation

Dieses Verfahren beinhaltet das Eintauchen der Probe in eine wässrige Lösung, die entweder Harnstoff oder Formamid enthält, um die Probe passiv zu reinigen. Wie bei anderen Passiv-Clearing-Verfahren auf wässriger Basis ist diese Methode vergleichsweise langsam und kann bei größeren Proben mehrere Wochen dauern. Harnstoff bzw. Formamid unterstützen die Hydratation von Proteinen durch die Erzeugung von osmotischen Gradienten in den Proteinstrukturen. Der optionale Einsatz von Detergenzien führt zu einer Zerstörung der Lipide und Lipidmembranen und erhöht die Clearingqualität, verhindert aber eine Lipidfärbung. Ein klarer Vorteil der Methode ist die Konservierung fluoreszierender Proteine, was für den Nachweis von endogen exprimierten Proteinen von entscheidender Bedeutung sein kann.

4) Hydrogele

Das Prinzip beim Hydrogel-basierten Clearing besteht darin, Proteine mit einem Hydrogel zu vernetzen, Lipide mit Detergenzien zu entfernen und dann den Brechungsindex der Proben auf eine Lösung mit einem Brechungsindex von 1,38 bis 1,45 abzustimmen. Dies wird oft durch Perfusion eines ganzen Tieres mit einem Fixiermittel, einem temperaturabhängiger Crosslinker und dem Hydrogel erreicht. Zu den Vorteilen zählen hervorragende Ergebnisse beim Clearing sowie die Kompatibilität mit Fluorophoren auf Proteinbasis. Die Standardmethoden sind jedoch relativ langsam, aber neue Anpassungen des Protokolls, die die Verwendung von Elektrophorese zur Beschleunigung des Clearing-Prozesses beinhalten, sind verfügbar, erfordern jedoch eine spezielle Ausrüstung [7].

Clearing-basierte Verfahren haben in den vergangenen Jahren enormes Interesse erregt und wurden, insbesondere im Hinblick auf die Beschleunigung des Prozesses, enorm verbessert. Gewebe-Clearing ist heute sowohl mit der Verwendung von Immunfärbungen durch Fluoreszenz-markierte Antikörper kompatibel als auch mit dem Einsatz von endogenen, Protein-basierenden Fluorophoren. Der kürzlich vorgestellte vDISCO-Ansatz verwendet zudem neuartige fluoreszenzmarkierte Nanokörper, die typischerweise viel kleiner sind (15-20 kDa) als herkömmlich verwendete Antikörper (ca. 150 kDa). Es ist anzunehmen, dass zahlreiche weitere Anpassungen an bestehende Protokolle auch in den nächsten Jahren zu großen Fortschritten im Tissue-Clearing führen.

Lichtblattmikroskopie

Wie bei der Gewebeklärung wurde die Methodik der Lichtblattmikroskopie Anfang des 20. Jahrhunderts erfunden. Richard Zsigmondy und Henry Siedentopf waren die Pioniere bei der Entwicklung der Methode, die ursprünglich als „Ultramikroskopie“ bezeichnet wurde. Das Wesentliche dieser Methode ist die Trennung des Beleuchtungslichtpfads von dem des Detektionspfads. Dies wird erreicht, indem das Objekt mit einem Lichtblatt beleuchtet wird und die optischen Informationen unter Verwendung einer orthogonal ausgerichteten Sammellinse gesammelt werden (Abb. 2a). Auf diese Weise wird Licht, das in der Fokusebene gesammelt wird, nicht durch Unschärfeinformationen beeinträchtigt, die normalerweise mit einem Standard-Weitfeld-Beleuchtungsmikroskop erfasst werden (Abb. 2b). Neben dem erhöhten Kontrast und der erhöhten Auflösung werden Phototoxizität und Photobleichung (Abb. 2c,d) aufgrund der geringeren Größe des Beleuchtungspfads drastisch reduziert. Zusammen machen diese Merkmale die Lichtblattmikroskopie zu einer idealen Methode für die Abbildung großer biologischer Proben.

Infrarot fluoreszierende Proteinmarkierung

Traditionell werden Proteine in biologischen Geweben durch Immunhistochemie sichtbar gemacht, was v.a. in dünnen Gewebeschnitten gut funktioniert, da hier das Eindringen von Antikörpern ins Gewebe kein Problem darstellt. Die Färbung ganzer Gewebe, wie z. B. eines Gehirns, ist in Bezug auf Zeit, Kosten aufgrund der erforderlichen Antikörpermenge und Endergebnisqualität nur eingeschränkt möglich. Alternativ können Proteine durch die Verwendung genetischer Modelle sichtbar gemacht werden, bei denen das interessierende Protein endogen mit einem fluoreszierenden Protein verbunden ist. Fluoreszierende Fusionsproteine sind jedoch nicht immer Mittel der Wahl, oft ändern sich die Aktivitäts- bzw. Expressionsmuster des Ausgangsproteins, die Signalintensität bleibt vergleichsweise gering, und die Auswahl an fluoreszierenden Proteinen mit passendem Anregungs- und Emissionsspektrum ist zudem begrenzt.

Eine alternative Methode zur Fluoreszenzmarkierung von Proteinen ist die chemische Kopplung von primären oder sekundären aliphatischen Aminen mit einem Fluoreszenzfarbstoff. Für die Markierung des 17 kDa großen Peptidhormones Leptin haben wir hierzu ein im Handel erhältliches IRDye 800CW-Proteinkennzeichnungskit verwendet, welches für zahlreiche Proteine mit primären oder sekundären aliphatischen Aminen genutzt werden kann. Die Verwendbarkeit ist jedoch stark von der tertiären Proteinstruktur und der Zugänglichkeit der Amingruppen abhängig, zudem kann die Markierung kleiner Proteine Schwierigkeiten bereiten und zusätzliche Reinigungsschritte erfordern, die nicht im Kit enthalten sind. In unserem Fall konnten wir die Reinheit unseres Leptin-CW800 Konjugats mittels Ionenaustauschchromatographie erhöhen. Einzeln isolierte Fraktionen enthielten hierbei markiertes Leptin mit variierender Anzahl an gebundenen Farbstoffmolekülen. Diese Fraktionen wurden im Anschluss erfolgreich auf ihre Bioaktivität getestet.

Die Wahl des Farbstoffes CW800, der sein Emissionsspektrum im infraroten Bereich besitzt, war v.a. auf zwei Hauptvorteile gegenüber anderen Fluorophoren mit kleineren Wellenlängen zurückzuführen. Der erste ist die Zunahme der Lichtdurchdringung aufgrund der Abnahme der Absorption und der sogenannte Mie-Streuung durch das umgebende Gewebe, was zu einer erhöhten Signalerfassung und somit zu einem verbesserten Kontrast führt. Eine Abnahme der Autofluoreszenz ist der zweite Hauptvorteil der Verwendung von Infrarotfluoreszenz, was wiederum zu einem dramatischen Anstieg der Signal-to-Noise Ratio in den erhaltenen Bildern führt.

Leptinresistenz und die Zukunft der Fettleibigkeit

Durch die Kombination dieser Methoden konnten wir erstmals die Leptin-Akkumulation im gesamten Gehirn einer Maus direkt nachweisen und visualisieren. Hier entdeckten wir, dass Leptin sich am meisten in den Plex -us choroides anreichert (Abb. 2b,c). Diese werden oft zu den zirkumventrikulären Organen hinzugerechnet und befinden sich in den Ventrikeln, wo sie für die Bildung der Cerebrospinalflüssigkeit verantwortlich sind. Leptin im Blut bindet die auf der Zelloberfläche der Plex -us choroides exprimierten Leptinrezeptoren und wird durch die Zellen in die Cerebrospinalflüssigkeit transportiert, wodurch es in andere Bereiche des Gehirns weiter transportiert werden kann. Insgesamt konnten wir zeigen, dass sich Leptin sowohl in dünnen als auch in fettleibigen Mäusen in ausreichender Menge ansammelt. Dies deutet darauf hin, dass die zugrundeliegende Ursache der Leptinresistenz nicht mit dem Transport über die Blut-Hirn-Schranke zusammenhängt, sondern eher ein Defekt in den Neuronen selbst sein muss. Mit dieser neuartigen Information können wir uns nun auf die intrazellulären Mechanismen als Ursache für Leptinresistenz konzentrieren. Sobald die intrazellulären Signalwege und die neuronalen Netzwerke vollständig verstanden sind, können wir eine Behandlung finden, die fettleibige Patienten dabei unterstützt, Gewicht zu verlieren und schlank zu bleiben.

Autoren

Luke Harrison^1,2,3,4 und Paul Pfluger^1,2,3

Zugehörigkeiten
¹ Research Unit Neurobiology of Diabetes, Helmholtz Zentrum München, Neuherberg, Deutschland
² Institute for Diabetes and Obesity, Helmholtz Zentrum München, Neuherberg, Deutschland
³ German Center for Diabetes Research (DZD), Neuherberg, Deutschland
⁴ Division of Metabolic Diseases, Technische Universität München, Munich, Deutschland

Kontakt
Dr. Paul Pfluger
Research Unit NeuroBiology of Diabetes
Helmholtz Zentrum München GmbH
Neuherberg, Deutschland
paul.pfluger@helmholtz-muenchen.de
www.helmholtz-muenchen.de/nbd

Originalpublikation:

Harrison, L. et al.: Fluorescent blood–brain barrier tracing shows intact leptin transport in obese mice. International Journal of Obesity (2018) doi:10.1038/s41366-018-0221-z

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Übersicht zu Tissue-Clearing Methoden

Literatur

[1] Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung: S. Hirzel; 1914.
[2] Dodt H-U, Leischner U, Schierloh A, Jährling N, Mauch CP, Deininger K, et al., 2007. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods 331
[3] Erturk A, Becker K, Jahrling N, Mauch CP, Hojer CD, Egen JG, et al., 2012. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc 11:1983-95
[4] Pan C, Cai R, Quacquarelli FP, Ghasemigharagoz A, Lourbopoulos A, Matryba P, et al., 2016. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods 859
[5] Cai R, Pan C, Ghasemigharagoz A, Todorov MI, Förstera B, Zhao S, et al., 2019. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull–meninges connections. Nature Neuroscience 2:317-27
[6] Becker K, Hahn CM, Saghafi S, Jährling N, Wanis M, Dodt H-U, 2014. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLOS ONE 12:e114149
[7] Lee E, Choi J, Jo Y, Kim JY, Jang YJ, Lee HM, et al., 2016. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports 18631