On-line-Kopplung von Nano-LC zu CZE-MS

Charakterisierung von Proteinen auf intakter Ebene

  • Abb. 1: Schematische Darstellung des Nano-LC-CZE-MS Systems: Die 1. Dimension besteht aus einer Nano-LC-Pumpe, die mit dem Sechs-Wege-Ventil eines QTOF-Instruments zur Probeninjektion (200 nL) verbunden ist: Position A (Beladen der Probenschleife) und Position B (Analyse). Die Säule befindet sich in einem selbstgebauten Säulenofen. Die Auslasskapillare ist nach einen UV-Detektor mit dem Vier-Wege-Ventil verbunden. Die Probenschleife (20 nL) befindet sich direkt auf dem Rotor des Vier-Wege-Ventils. Das CZE-MS-System ist ebenfalls über eine Kapillare mit dem Vier-Wege-Ventil verbunden. Während der Trennung in der 1. Dimension (Nano-LC-UV) befindet sich das Vier-Wege-Ventil in Position C. Der Zeitpunkt zum korrekten Transfer eines Analyten in die 2. Dimension (C → D) wird über den externen UV-Detektor bestimmt. Nach Übergabe des Analyten wird die Trennspannung (+15 kV) in der CZE-MS-Dimension angelegt.
  • Abb. 2: Nano-LC-CZE-MS-Analyse von Modellproteinmix. (A) Chromatogramm der Trennung von RNAse B (100 µg mL-1), Cytochrom C (80 µg mL-1), Lysozym (80 µg mL-1) und Myoglobin (50 µg mL-1) mittels Nano-LC-UV (214 nm). (B) CZE-MS-Elektropherogramm der Trennung der verschiedenen Glykoformen des aus der Nano-LC-Dimension ausgeschnitten RNAse B-Peaks.
  • Abb. 3: Konvolutierte und dekonvolutierte Massenspektren der nicht glykosylierten Variante (A) (26,1-26,3 min) und den verschiedenen Glykoformen (B) (27,9-29,5 min) von RNAse B.

 

Multidimensionale Trenntechniken spielen eine immer wichtigere Rolle für die Trennung komplexer Proben, beispielsweise zur Charakterisierung von Proteinen. Sowohl aufgrund der nahezu orthogonalen Trennmechanismen als auch den zueinander passenden Geometrien ist die Kopplung von Nano-LC (Umkehrphase) und CZE (capillary zone electrophoresis) besonders vielversprechend.
 
 
In der hier vorgestellten Machbarkeitsstudie wurde ein Modellproteinmix (i) zunächst über Nano-LC aufgetrennt, (ii) einzelne Proteinspezies in einem „heart-cut“-Ansatz mithilfe eines mechanischen Vier-Wege-Ventils in die zweite Trenndimension (CZE-MS) überführt und (iii) anschließend nach ihren Proteoformen aufgetrennt und charakterisiert.
 
Generelles Konzept und Aufbau des LC-CE-MS-Systems
Sowohl LC als auch CZE sind effiziente Trenntechniken für die Analyse verschiedenster komplexer Proben. Nichtsdestotrotz sind die Anforderungen an Trennleistung und Sensitivität in den letzten Jahren stark gestiegen, was schlussendlich zur Entwicklung und Verbreitung multidimensionaler Trenntechniken führte [1]. Die Trennmechanismen von RPLC (Interaktion mit hydrophober stationärer Phase) und CZE (elektrophoretische Mobilität) sind nahezu orthogonal, wodurch deren Kombination zweifellos ein leistungsfähiges 2D-Trennsystem darstellt. Dabei gilt es jedoch besondere Aspekte zu berücksichtigen:
 
 
  • (i) Kompatibilität der Trennung (Flussrate, Geometrie, Elutionsbedingungen etc.) von LC und CE,
  • (ii) der Transfer sehr kleiner Peakvolumina im Bereich weniger Nanoliter und
  • (iii) die elektrische Isolierung der CE-Dimension.
Obwohl eine Online-Kopplung von LC und CZE bereits in den frühen 90er-Jahren erstmals erreicht wurde [2,3] und anschließend einige Kopplungstechniken entwickelt wurden, gibt es kein direkt anwendbares System, welches dann auch eine anschließende Kopplung an ein Massenspektrometer erlaubt [4,5]. Hier wurde ein Nano-LC-CZE-MS-System entwickelt basierend auf einem Vier-Wege-Ventil als LC-CE-Schnittstelle, welches bereits in vorherigen Arbeiten erfolgreich zur CE-CE-MS-Kopplung eingesetzt wurde [6].

Der grundlegende Aufbau und die Funktionsweise des 2D-Systems sind in Abbildung 1 schematisch dargestellt.

 
Methodenentwicklung: Nano-LC-UV-Dimension
 
Zunächst wurde eine Nano-LC-UV-Methode zur Proteintrennung entwickelt. Ein Proteinmix bestehend aus Ribonuclease B (RNAse B), Cytochrom C, Lysozym C und Myoglobin wurde als Modellsystem ausgewählt und analysiert. Ein Sechs-Wege-Ventil mit einer mit Polyvinylalkohol (PVA) beschichteten Probenschleife (ID = 50 µm, L = 10 cm, V = 200 nL; Protokoll zur PVA-Beschichtung in [7]) diente zur Injektion. Basierend auf Tests verschiedener Methodenparameter wurde in der Nano-LC folgendermaßen getrennt: Die mobile Phase A bestand aus 10 % Acetonitril (ACN) und 0,05 % Trifluoressigsäure (TFA), die mobile Phase B setzte sich aus 100 % ACN und 0,05 % TFA zusammen. Gradient: 0-2 min: 0 % B, 2-30 min: 100 % B, 30-34 min: 100 % B, 34-36 min: 100-0 % B, 36-44 min: 0 % B. Die Säulentemperatur wurde auf 50 °C festgelegt, welches die beste Verbesserung der Auflösung im Vergleich zu Raumtemperatur erbrachte (Faktor = 1,17-1,25).
 
Methodenentwicklung: CZE-MS-Dimension
Verschiedene Hintergrundelektrolyte (basierend auf Ameisen-/Essigsäure) wurden hinsichtlich der Trennung der Glykoformen des Modellproteins RNAse B getestet. 0,2 M Ameisensäure zeigte dabei die beste Auflösung und wurde daraufhin für alle weiteren Experimente verwendet. Allgemein eluiert ein Großteil aller Proteine in RPLC unter Bedingungen mit hohem organischen Anteil. Daher wurde der Einfluss von organischem Lösemitteln (ACN, Methanol (MeOH)) auf die Stabilität der CZE getestet (Strom, Trennung). RNAse B (1 mg mL-1) wurde in verschiedenen Anteilen an organischen Lösemitteln (10-70 %) gelöst und mittels CZE analysiert. Es konnte nur ein geringer Einfluss auf das resultierende Stromprofil sowie die Trennung beobachtet werden. Folglich können diese gängigen LC-Eluentzusammensetzungen in diesem LC-CE-System verwendet werden, ohne die CZE Trennung im Wesentlichen zu beeinflussen.
 
Nano-LC-CZE-MS-Analyse des Modellproteingemischs
Als erster Test des Nano-LC-CZE-MS-Systems wurde ein Myoglobin-Standard (250 µg mL-1) analysiert. Relative Standardabweichungen (n = 3) von 0,21 % für die Migrationszeit und 18,2  % für die Peakintensität wurden bestimmt, basierend auf der Summe der elf Hauptladungszustände von Myoglobin. Anschließend wurde der Proteinmix analysiert und RNAse B aus der Nano-LC-Dimension ausgeschnitten (Abb. 2 A) und in die zweite Dimension überführt.
Mittels CZE wurden die verschiedenen Glykoformen von RNAse B aufgetrennt (Abb. 2 B). Wie erwartet, migrierte die nicht-glykosylierte Form von RNAse B vor den Glykoformen. Allgemein enthält RNAse B high-Mannose-N-Glykane mit fünf bis neun Mannose-Einheiten, die teilweise getrennt werden konnten. Die dazugehörigen Massenspektren (original und dekonvolutiert) sind in Abbildung 3 dargestellt, wobei über alle Glykoformen gemittelt wurde.
Ein wichtiges Kriterium für jeglichen 2D-Ansatz stellt die Effizienz der Übertragung eines Peaks von der ersten in die zweite Trenndimension dar. Basierend auf der Peakbreite/-form, der Nano-LC-Flussrate und dem Transfervolumen von 20 nL wurde eine Transfereffizienz von 14 % des RNAse B-Peaks bestimmt. Dieser Wert ist besser, als bei den meisten Flow-Gating-basierten LC-CE-Ansätzen erreicht werden kann. So wurde von Lemmo und Jorgenson beispielsweise eine Transfereffizienz von etwa 1 % abgeschätzt [8]. Nichtsdestotrotz kann die Transfereffizienz des hier vorgestellten 2D-Systems noch verbessert werden, z.  B. durch eine geringere Nano-LC-Flussrate oder ein größeres Transfervolumen. Dies wird Gegenstand zukünftiger Studien.
In einem weiteren Experiment wurden verschiedene Konzentrationen von RNAse B (10, 50, 500 µg mL-1) aus dem Proteinmix ausgeschnitten und charakterisiert (n = 3 pro Konzentrationslevel). Für die Hauptglycoform von RNAse B (Man5GlcNAc2) wurde exemplarisch die Linearität mit R2 = 0,9998 im untersuchten Konzentrationsbereich bestätigt. Des Weiteren wurde eine Nachweisgrenze von 3 µg mL-1 (S/N = 3) bestimmt [9].
 
Fazit
Erstmals konnte ein LC-CE-MS-System unter Verwendung eines mechanischen Ventils als LC-CE-Schnittstelle realisiert werden. Das entwickelte 2D-System profitiert einerseits von dem gesteigerten Injektionsvolumen der Nano-LC und andererseits von der Selektivität und der Trenneffizienz beider Dimensionen. Dies konnte exemplarisch in dieser Machbarkeitsstudie am Beispiel des Glykoproteins RNAse B gezeigt werden. Durch den Einsatz einer Vorsäule zur Probenanreicherung können noch größere Probenmengen injiziert und so noch bessere Nachweisgrenzen erreicht werden. Damit werden zukünftig vielversprechende Anwendungen, etwa zur Analytik von Metaboliten oder Proteoformen von intakten Proteinen in biologischen und klinischen Proben oder auch Anwendungen im Umweltbereich, möglich.
 
Zugehörigkeiten
1Hochschule Aalen, Fakultät Chemie, Deutschland
2Forschungseinheit Analytische BioGeoChemie, Helmholtz Zentrum München, Neuherberg, Deutschland
#jetzt: Agilent Technologies R&D and Marketing, Waldbronn, Deutschland
 
 
​Autoren
 
Kevin Jooß
Nico Scholz
Jens Meixner
Christian Neusüß
 
​Kontakt
Prof. Dr. Christian Neusüß
Institut für Analytische und Bioorganische Chemie
Hochschule Aalen, Aalen, Deutschland
Christian.neusuess@hs-aalen.de

Fortschrittliche Chromatographie

 

Literatur:

[1]: Giddings, J. C., J. High Resol. Chromatogr. 1987, 10, 319–323.

[2]: Yamamoto, H., Manabe, T., Okuyama, T., J. Chromatogr. 1989, 480, 277–283.

[3]: Bushey, M. M., Jorgenson, J. W., Anal. Chem. 1990, 62, 978–984.

[4]: Ranjbar, L., Foley, J. P., Breadmore, M. C., Anal. Chim. Acta 2017, 950, 7–31.

[5]: Lewis, K. C., Opiteck Gregory J., Jorgenson, J. W., Sheely, D. M., J. Am. Soc. Mass Spectrom.1997, 495–500.

[6]: Schlecht, J., Jooß, K., Neusüß, C. Anal. Bioanal. Chem. 2018, 410(25), 6353–6359.

[7]: Hühner, J., Jooß, K., Neusüß, C., Electrophoresis 2017, 38, 914–921.

[8]: Lemmo, A. V., Jorgenson, J. W., Anal. Chem. 1993, 65, 1576–1581.

[9]: Jooß, K., Scholz, N., Meixner, J., Neusüß C., Electrophoresis. 2018 Dec 21. doi: 10.1002/elps.201800411

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