Linsenlose Mikroskopie von Zellkulturen

Live-Cell-Imaging im Inkubator mit linsenlosem Zell-Mikroskop

  • Abb. 1: Linsenlose Mikroskopie von Fibroblasten, einpipettiert in einen Zellkulturkanal (links) und identisches Sichtfeld nach 91 Stunden Inkubationszeit zeigt die Zelladhäsion und Proliferation (rechts). Skala: 1000 µm. Video zu Abb. 1 siehe online unter: http://bit.ly/Hubl-VideoAbb. 1: Linsenlose Mikroskopie von Fibroblasten, einpipettiert in einen Zellkulturkanal (links) und identisches Sichtfeld nach 91 Stunden Inkubationszeit zeigt die Zelladhäsion und Proliferation (rechts). Skala: 1000 µm. Video zu Abb. 1 siehe online unter: http://bit.ly/Hubl-Video
  • Abb. 1: Linsenlose Mikroskopie von Fibroblasten, einpipettiert in einen Zellkulturkanal (links) und identisches Sichtfeld nach 91 Stunden Inkubationszeit zeigt die Zelladhäsion und Proliferation (rechts). Skala: 1000 µm. Video zu Abb. 1 siehe online unter: http://bit.ly/Hubl-Video
  • Abb. 2: Das gesamte Sichtfeld des linsenlosen Zellmikroskops, verglichen mit einem Phasenkontrastmikroskop mit 4x und 10x Objektiv (links). Die Ablösung vom Substrat und Abrundung während der Zellteilung von Fibroblasten ist klar im Hologramm zu erkennen (rechts). Skala: 100 µm
  • Abb. 3: Fibroblasten mit unterschiedlicher Größe und Adhäsionszustand als Hologramm (links), rekonstruiert zu einem fokussiertem Bild (mittig) und unter einem Phasenkontrastmikroskop (rechts). Skala: 100 µm
  • Abb. 4: Das linsenlose Zellmikroskop mit eingelegtem Zellkulturkanal (links) kann innerhalb eines Inkubators platziert werden um Zellkulturen bis zu mehreren Tagen zu mikroskopieren (mittig). Das rechte Diagramm zeigt die logarithmische Wachstumskurve von zwei Fibroblasten Zellkulturen mit anfänglicher lag-Phase, exponentiellem Wachstum und anschließender stationärem Phase aufgrund von Nährstoffmangel. Ein Temperaturanstieg auf 39,5 °C verursachte eine Wachstumshemmung von 4 Stunden (blauer Graph).
  • Abb. 5: Segmentierung der Zellhologramme (links) um die Zellen auszuzählen und die Zellabstammung per Tracking zu verfolgen. Die drei ursprünglich verfolgten Zellen, markeirt mit *, zeigen unterschiedliche Charakteristiken hinsichtlich der zurückgelegten Distanz und Teilungsrate (mittig). Skala beide: 250 µm. Ungewöhnliche dreifache Zellteilung eines degenerierten Fibroblasten dargestellt als Hologramm und rekonstruiert zu einem fokussiertem Bild (rechts). Skala: 50 µm. Videos zu der Abbildung siehe http://bit.ly/Hubl-Video

Das linsenlose Zell-Mikroskop kombiniert die holografische Abbildung von Zellen mit einem thermoelektrischen Kühlungssystem und der automatisierten Segmentierung von Zellen für das Live-Cell-Imaging innerhalb des Inkubators. Die Anwendung von Holografie anstatt einer optischen Fokussierung erlaubt es ein kostengünstiges, robustes und kompaktes Mikroskop zu bauen. Die Kühlung der CMOS-Kamera bestimmt dabei die lokale Temperatur der eingesetzten Zellkulturkammer. Innerhalb des großen Sichtfeldes können dadurch tausende von Zellen mikroskopiert, segmentiert, ausgezählt und fortlaufend verfolgt werden.

In den 1950er Jahren ist mit der in-vitro Kultivierung einer unsterblichen Zelllinie ein komplett neues Wissenschaftsfeld entstanden, dessen umfangreichste Nutzung noch bevorsteht. Zellkulturen erlauben es das Verhalten von Zellen, angefangen von der einzelnen Zelle bis hinzu komplexem Gewebe, unter verschiedensten Einflüssen und unter definierten Randbedienungen zu studieren. In Zukunft kann von einem enormen Zuwachs an zellbasierten Untersuchen, aufgrund der Weiterentwicklungen in den Gebieten der regenerativen Medizin, des Tissue Engineering und der Zelltherapie ausgegangen werden.

Zellen unter Beobachtung

Das Live-Cell-Imaging mit einem Zellmikroskop ist das wichtigste Analysewerkzeug um Zellen zu untersuchen. Neue Methoden in der optischen Mikroskopie haben die Auflösung weit unter die Beugungsgrenze gestoßen. Nichtsdestotrotz verlangen linsenbasierte Mikroskope einen Kompromiss zwischen Auflösung und Sichtfeld. Eine geringe Vergrößerung liefert statistisch signifikante Zellzahlen, allerdings auf Kosten der geringeren Auflösung. Dieser Artikel präsentiert eine neue Methoden des Live-Cell-Imagings für aussagekräftige Zellkulturversuche ohne die Notwendigkeit von zusätzlichem Laborequipment, wie z.B. Mikroskop-Inkubationskammern [1]. Mit der linsenlosen Mikroskopie ist es möglich durch den Einsatz von Holografie Zellen fortlaufend innerhalb eines großen Sichtfeldes abzubilden [2, 3]. Die digitalisierten Zellhologramme liefern eine höhere Informationsdichte als konventionelle Lichtmikroskopaufnahmen. Neben der kontrastreichen Abbildung, ohne der Notwendigkeit eines Markers oder Phasenkontrasts, ist es möglich den Objektabstand und den Adhäsionszustand der Zellen zu bestimmen (Abb.

2). Dies ist ein wichtiges Kriterium um die Biokompatibilität bei adhärenten Zellkulturen zu bestimmen, welches mit herkömmlichen Phasenkontrastmikroskopen nicht zu erkennen ist [4]. Darüber hinaus können die Hologramme, aufgrund ihrer inhärenten dreidimensionalen Bildinformationen digital über eine zweifache inverse Fouriertransformation zu fokussierten Aufnahmen mit variablem Fokusabstand rekonstruiert werden [5] (Abb. 3).

Linsenlose Zellmikroskopie


Das linsenlose Mikroskop basiert auf der in-line Holografie. Eine rote Laserdiode emittiert kohärentes Licht, welches die Referenzwelle repräsentiert. Nach einer Distanz von rund 4 cm trifft die Wellenfront auf den Zellkulturkanal und wird an den Zellen gestreut, was fortan die Objektwelle darstellt. Diese interferiert mit dem ungestreutem Anteil der Referenzwelle auf der 750 μm darunterliegenden Sensoroberfläche. Ein 10 Megapixel CMOS Sensor digitalisiert die individuellen Zell-Hologramme [6]. Da das System nicht durch Linsen begrenzt ist entspricht das resultierende Sichtfeld den Sensordimensionen von 29,4 mm2, welches damit eine Größenordnung größer ist als vergleichbare Lichtmikroskope mit 4x Objektiv (Abb. 2 links). Das linsenlose Zellmikroskop passt aufgrund seiner minimalen Baugröße von 12 cm x 6 cm x 10 cm mühelos in einen Zellinkubator (Abb. 4 mittig).

Peltierkühlung der Mikroskopkamera

Um einen thermischen Effekt auf die Zellen zu vermeiden wird die Temperatur der Kamera mittels thermoelektrischer Kühlung auf 37°C gehalten. Das Peltierelement ist dabei unterhalb der Platinenkamera montiert. Ein Temperatursensor ist am Bildsensor angebracht und misst kontinuierlich dessen Temperatur. Die Temperaturdaten werden von einem externen Temperaturregler geloggt und ausgewertet, der falls notwendig die Kühlungsleistung anpasst. Fortlaufende Bildaufnahmen mit einer selbstprogrammierten Bilderfassungssoftware ermöglichen Zeitrafferaufnahmen der Zellkulturen über einen Zeitraum von mehreren Tagen. Die Bildaufnahme verursacht allerdings zusätzliche Wärme in der Kamera, vor allem im CMOS Sensor. Um ein Anstieg der Temperatur in der Kulturkammer zu verhindern sendet die Kamerasoftware kurz vor jeder Aufnahme ein Signal an die Temperatursteuerung um die Vorkühlung der Platinenkamera einzuleiten. Die Temperaturmessung innerhalb des Zellkanals zeigt bei Aufnahme somit nur einen minimalen Temperaturoffset von 0,3°C, welcher innerhalb der Temperaturtoleranz des verwendeten Inkubators liegt und daher vernachlässigt werden kann.

Linsenloses Live-Cell-Imaging von Zellkulturen

Das in-vitro Zellwachstum einer L-929 Fibroblasten Kultur wurde alle 10 Minuten über 7 Tage in mehr als 1000 Aufnahmen aufgezeichnet und als Zeitraffervideo visualisiert (Abb. 1). Die aufgenommenen Hologrammbilder zeigen abgesehen von der Zellgröße und Position auch den Adhäsionszustand. Während adhärente Zellen einen hellen inneren Kern im Hologrammbild besitzen, verursachen nicht-adhärente Zellen durch ihre Kugelform eine veränderte Lichtbrechung was einen dunkleren Hologrammkern zur Folge hat. Dies ist eine hilfreiche Eigenschaft für die Detektion von sich teilenden oder toten Zellen und um die Teilungsrate der beobachteten Zellkultur zu bestimmten [2] (Abb. 2 rechts). Automatisierte Segmentierung der unterschiedlichen Zellhologramme mit dem Open-Source Bildverarbeitungsprogramm LineageTracker ermöglicht es Zellen zu zählen. Aufgetragen über die Zeit entsteht eine kontinuierliche Wachstumskurve, welche die Zellproliferation abbildet (Abb. 4 rechts). Die Verifizierung des Segmentierungsalgortihmuses für adhärente Zellen offenbart eine hohe Sensitivität von 95% und Spezifität von 98% (Abb. 5 links) [1]. Die aufgetragene Wachstumskurve der Fibroblastenkultur zeigt keinen Einfluss durch das Zell-Mikroskop mit einem ungehemmten Wachstum in der exponentiellen Phase. Die holografische Zellmikroskopie kann daher für automatisierte Zytotoxizitätstests mit Echtzeit-Analyse der Proliferationskinetik verwendet werden. Die Bedeutung dieser innovativen Bildgebung wird hervorgehoben durch die Tatsache, bis zu 20000 Fibroblasten einer konfluenten Zellschicht mit nur einem Bild darzustellen. Wir haben ebenfalls demonstriert, dass es möglich ist den gesamten Zellkulturkanal von 2,5 cm2 durch Bildzusammensetzung abzubilden und Zellen in Größenordnungen auszuzählen, die bisher der Durchflusszytometrie vorbehalten waren [1].

Zelltracking


Die segmentierten Zellen können über die gesamte Versuchszeit verfolgt werden um die Zellmigration, Geschwindigkeit, Teilungsrate und Zellabstammung darzustellen. Diese Charakteristiken werden in Chemotaxis-Assays untersucht, um beispielsweise die Zellbewegungen und die Zellteilungen bei Wundheilungsversuchen zu analysieren [3]. Wir haben die Bahnen mehrere Zellen visualisiert und unter Anderem festgestellt, das Mutterzellen, die eine große Distanz zwischen der Zellteilung zurückgelegt haben, diese Attribute an ihre Tochterzellen weiterreichen (Abb. 5 mittig).

Temperaturinduzierte Wachstumshemmung


Der geringe Abstand von 750 μm zwischen dem Kulturkanal und dem Bildsensor hat einen nahezu direkten thermischen Kontakt zur Folge. Daher kann die lokale Temperatur der Zellkulturkammer über die Peltierkühlung der Platinenkamera in einem Bereich von 10°C - 60°C gesteuert werden. Wir haben gezeigt, dass eine Temperaturerhöhung des CMOS Sensors auf 39,5°C für 20 s eine stark verringertes Zellwachstum für 4 Stunden zur Folge hat und anschließend wieder zu einem exponentiellen Wachstum zurückkehrt (Abb. 4 rechts). In diesem Zeitraum wurde kein Absterben von Zellen beobachtet.

Mutierte Zellen mit abnormaler Zellteilung

Anhand der großen Anzahl an Zellen innerhalb des Sichtfeldes ist es wahrscheinlicher seltene Ereignisse in der Zellkultur zu entdecken, so wie die dreifache Teilung einer mutierten Zelle. Diese ungewöhnliche Zellteilung wurde im Hologrammbild identifiziert und für eine detaillierte Untersuchung in ein fokussiertes Bild rekonstruiert (Abb. 5 rechts). Die Analyse der degenerierten Zelle im Zeitraffer hat gezeigt, dass die teilende Zelle sich während der Zytokinese nicht vollständig trennen konnte und sich wieder in einem Zellkörper vereint. Darauffolgende Zellteilungen zeigten identische Funktionsstörungen. Die unvollständige Zellteilung führte schließlich zu einer Riesenzelle mit etlichen Zellkernen und 20-facher Größe gegenüber einem durchschnittlichen adhärenten Fibroblasten.

Fazit


Die linsenlose Zell-Mikroskopie bietet großes Anwendungspotential für automatische Überwachung von Zellkulturen, zur Analyse des Zellverhaltens und die Quantifizierung der Proliferationskinetik bei Zellversuchen, Zytotoxizitäts- und Medikamententests. Dies alles in einem kompakten, robusten und kostengünstigem Mikroskopsystem, welches durch sein großes Sichtfeld aussagekräftige Analysen von Zellen direkt im Inkubator ermöglicht.

Danksagung

Der Autor möchte sich bei E. Jung und K.D. Lang für die Möglichkeit in diesem interessantem Forschungsfeld zu arbeiten, M. Blechert für die Realisierung des Kühlungssytems und M. Engelhardt für die Entwicklung der Bildaufnahmesoftware bedanken.

Referenzen

[1] Hubl M.: Masterarbeit, TU Berlin (2014)
[2] Kesavan S.V. et al.: Journal of Biomedical Optics 19 (2014)
[3] Pushkarsky I. et al.: Scientific Reports 4, 4717 (2014)
[4] Wintermantel E. et al.: Life Science Engineering, Springer (2009)
[5] Isikman S.O. et al.: Lab on a Chip 10, 1109-12, (2010)
[6] Hubl M. et al.: Microscopy Conference 2013, Regensburg (2013)
[7] Downey M. et al.: ISBI2011 Proceedings, 1913-1916 (2011)

Videos zu Abb. 1 und 5: http://www.imaging-git.com/tags/hubl-video

Englische Version des Artikels: http://www.imaging-git.com/

Mehr Informationen zum Thema Zellkultur finden Sie unter http://www.git-labor.de

Autor(en)

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Fraunhofer-Institut für Zuverlässigkeit und Mikrointegration IZM
Gustav-Meyer-Allee 25
13355 Berlin
Germany

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