LINuS: Mit Licht Zellen steuern

  • Abb. 1: (A) Schematische Darstellung der Funktionsweise von LINuS. Im Dunkeln ist die hybride Jα-Helix gefaltet und interagiert mit der LOV2-Zentraldomäne. Blaues Licht führt zur Entfaltung der Jα-Helix und macht das Kernimportsignal (NLS) zugänglich. (B) Lokalisation des mCherry-LINuS-Proteins in verschiedenen menschlichen Zelllinien vor und nach der Aktivierung durch blaues Licht, sowie nach einer anschließenden Erholungsphase im Dunkeln (Quelle: abgeändert nach Niopek et al., Nat. Comm. 2013).Abb. 1: (A) Schematische Darstellung der Funktionsweise von LINuS. Im Dunkeln ist die hybride Jα-Helix gefaltet und interagiert mit der LOV2-Zentraldomäne. Blaues Licht führt zur Entfaltung der Jα-Helix und macht das Kernimportsignal (NLS) zugänglich. (B) Lokalisation des mCherry-LINuS-Proteins in verschiedenen menschlichen Zelllinien vor und nach der Aktivierung durch blaues Licht, sowie nach einer anschließenden Erholungsphase im Dunkeln (Quelle: abgeändert nach Niopek et al., Nat. Comm. 2013).
  • Abb. 1: (A) Schematische Darstellung der Funktionsweise von LINuS. Im Dunkeln ist die hybride Jα-Helix gefaltet und interagiert mit der LOV2-Zentraldomäne. Blaues Licht führt zur Entfaltung der Jα-Helix und macht das Kernimportsignal (NLS) zugänglich. (B) Lokalisation des mCherry-LINuS-Proteins in verschiedenen menschlichen Zelllinien vor und nach der Aktivierung durch blaues Licht, sowie nach einer anschließenden Erholungsphase im Dunkeln (Quelle: abgeändert nach Niopek et al., Nat. Comm. 2013).
  • Abb. 2: (A) Repräsentative Mikroskopieaufnahmen von humanen HeLa-Zellen, die die Cyclin B1-mCherry-LINuS und CDK1-mCherry-LINuS Fusionsproteine exprimieren. Gezeigt sind Hela- Zellen vor (links) und nach (rechts) der Aktivierung durch blaues Licht . Die gelben Pfeile markieren Zellen, die aufgrund der Lichtinduktion in die Mitose eintreten. (B) Quantifizierung der lichtabhängigen Mitoseinduktion in den Cyclin- B1-mCherry-LINuS und CDK1-mCherry- LINuS exprimierenden Zellen vor und nach Bestrahlung mit blauem Licht (Quelle: abgeändert nach Niopek et al., Nat. Comm. 2013).

Die Funktionen vieler Proteine werden durch Änderungen ihrer subzellulären Lokalisation gesteuert. Um diese Dynamik im Labor gezielt simulieren und so die Effekte von Lokalisationsänderungen erforschen zu können, wurde an der Universität Heidelberg und am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) eine neue Methode entwickelt, mit der Proteine in lebenden Zellen über Lichtsignale gesteuert werden können. Das neue System heißt LINuS (light-inducible nuclear localization signal) und erzeugt ein durch Licht induzierbares Signal, mit dem Proteine gezielt in den Zellkern gelenkt werden können. Dieses System ermöglicht nun Studien über die Bewegung von Proteinen innerhalb der Zelle und ist daher sowohl für die Grundlagen- als auch für die angewandte Forschung interessant.

Vielen grundlegenden Prozessen in eukaryontischen Zellen, beispielsweise Zellteilung, Zellwachstum, Stoffwechsel und Zellbewegung, liegt eine streng kontrollierte und dynamische Regulation zugrunde, die häufig durch die koordinierte Aktivierung bestimmter Gene erfolgt. Die entsprechenden Signalproteine, beispielsweise die krebsrelevanten Transkriptionsfaktoren p53 und NF-κB, werden hierzu aus dem Zytoplasma in den Zellkern transportiert. Dort können sie durch die Bindung an bestimmte DNA-Bereiche direkt Einfluss auf die Expression ihrer Zielgene nehmen und so zelluläre Prozesse steuern. Das Ansteuern der Zielgene ist dabei häufig hochdynamisch, d.h. die Signalfaktoren springen zwischen Zytoplasma und Zellkern hin und her und erzeugen durch ihre raumzeitliche Bewegung bestimmte Gen-Aktivierungsmuster. Diese sind eine Art Code zur Kontrolle verschiedener zellulärer Prozesse.

Entscheidend für zukünftige Forschungsansätze ist daher nicht nur das einfache An- oder Abschalten bestimmter Gene, sondern insbesondere auch die Möglichkeit, deren Aktivität räumlich und zeitlich zu kon­trollieren.

Optogenetik: Steuerung zellulärer Prozesse durch Licht
Das Feld der Optogenetik, in der man Proteinaktivität über Licht steuern kann, entwickelt sich zur Zeit rapide, weil Licht der ideale „Schalter" ist, um Proteine in einzelnen Zellen zu steuern.

Ziel der Optogenetik ist die Steuerung zellulärer Prozesse über genetisch kodierte lichtempfindliche Proteine, die in der Natur in Pflanzen, Algen, Pilzen und Bakterien vorkommen. Diese Proteine verändern bei Licht bestimmter Wellenlängen ihre Struktur und können so genutzt werden, um externe Lichtsignale in intrazelluläre Signale umzuwandeln. Im Gegensatz zu chemischen Signalstoffen, die sich im Experimentalsystem durch Diffusion typischerweise frei bewegen und homogen verteilen, kann Licht unter dem Mikroskop sehr einfach lokal begrenzt verabreicht werden und ermöglicht so die gezielte Manipulation einzelner Zellen. Zudem hinterlässt Licht in der Zelle keine anderen Spuren, die wissenschaftliche Beobachtungen beeinflussen könnten. So können einfache, universell anwendbare Werkzeuge entwickelt werden, um gezielt und nahezu nebenwirkungsfrei in die Funktionsweise von Zellen eingreifen zu können. Ein prominentes Beispiel ist das Protein Channelrhodopsin 2 (ChR2). Dieser lichtempfindliche Ionenkanal kann durch genetische Modifikationen in Zellen oder Tiere eingebracht werden und ermöglicht beispielsweise die Erregung von Neuronen durch Lichtsignale (Photostimulation) [1]. Verschiedene optogenetische Ansätze wurden bereits genutzt, um Proteine im Zellkern zu akkumulieren, allerdings waren diese Systeme langsam und irreversibel oder benötigten externe Chromophore und waren daher für die Simulation komplexer raumzeitlicher Proteinbewegungen in einzelnen Zellen nicht gut geeignet [2,3].

Ein lichtinduzierbares Signal für die Kernlokalisation
LINuS jedoch ermöglicht die schnelle, reversible und justierbare Steuerung von Proteinen in den Zellkern. Da das System vollständig genetisch kodiert ist und keine Zugabe von externen Faktoren benötigt, besteht zudem die Möglichkeit, gezielt einzelne Zellen aus einem Zellverband zu untersuchen. Es basiert auf der LOV2-Domäne des lichtempfindlichen Proteins Phototropin 1, das in der Haferpflanze Avena sativa an der wachstumsvermittelten Bewegung in Richtung des Sonnenlichts (Phototropismus) beteiligt ist. Forscher aus Chicago haben 2012 erstmals die AsLOV2-Domäne für lichtabhängige Steuerung von einfachen, kurzen Signalpeptiden verwendet [4]. Am DKFZ nutzte man dieses Forschungskonzept und baute die AsLOV2 Domäne schrittweise in einen lichtabhängigen Protein-Shuttle-Service um, der auch in menschlichen Zellen funktioniert [5].

Das Prinzip ist einfach: Ein Kernimportsignal (nuclear localisation signal, NLS), das den Transport von Proteinen in den Zellkern vermittelt, ist im Dunkeln in der modifizierten LOV2-Domäne eingesperrt und daher inaktiv. Bei Einfall von blauem Licht (450-495 nm) wird die Jα-Helix am Carboxy-Terminus der LOV2-Domäne entfaltet. Das freigelegte NLS kann nun durch die Kernimportmaschinerie erkannt werden und bewirkt den Transport des mit LINuS markierten Proteins vom Zytoplasma in den Zellkern (Abb. 1A). Die Charakterisierung von LINuS mithilfe des roten fluoreszenten Reporterproteins mCherry zeigte, dass LINuS sowohl in Hefe, als auch in verschiedenen Säugerzelllinien genutzt werden kann, um das fluoreszente Signal in den Zellkern zu verlagern. Die folgende Inaktivierung von LINuS durch Abschalten des blauen Lichts führt zu einer Erholung des Systems: Das Protein wird mittels eines eingebauten Kernexportsignals (nuclear export signal, NES) aus dem Zellkern herausgebracht und sammelt sich wieder im Zytoplasma an (Abb. 1B). Dieses Verhalten konnte mithilfe von LINuS sogar mehrfach nacheinander ausgelöst werden. Darüber hinaus kann die Stärke des Signals über die Lichtintensität und die Dauer der Bestrahlung variiert werden und verschiedene Versionen können „personalisiert" an die Bedürfnisse des untersuchten Proteins angepasst werden. Dies eröffnet eine Vielzahl von denkbaren Anwendungsgebieten und ermöglicht nun die Erforschung komplexer raumzeitlicher Signale in der Zelle.

Steuerung zellulärer Prozesse durch Licht
Dieser Prozess gewährt Eingriffe in grundlegende, zelluläre Funktionen, wie beispielsweise die Zellteilung (Mitose). In Krebszellen verläuft die Mitose häufig schnell und unkontrolliert und führt so zu genetischen Defekten, die das Tumorwachstum verstärken oder die Resistenz gegenüber bestimmten Medikamenten fördern können. Außerdem sind in Krebszellen genetische Reparaturmechanismen häufig fehl- oder sogar ausgeschaltet. All diesen Prozessen liegt dabei eine komplexe, in gesunden Zellen wohlkoordinierte Bewegung der beteiligten Signalproteine zugrunde, die man mit LINuS nun besser verstehen kann. Um diese Prozesse genauer unter die Lupe zu nehmen, wurden fluoreszent markierte und durch LINuS aktivierbare Varianten von Zellzyklusproteinen konstruiert. Bereits niedrige Konzentrationen eines Komplexes aus Cyclin B1 und CDK1 (cyclin-dependent kinase 1) induzieren frühe mitotische Ereignisse, wie z.B. den Abbau der Kernmembran und das kugelförmige Abrunden der Zelle.

Um diese Ereignisse von außen kontrollieren zu können, wurden die Signalproteine Cyclin B1 und CDK1 unter die Kontrolle ihres lichtabhängigen Kernimports gestellt. Die zeitgleiche Translokation von Cyclin B1-mCherry-LINuS und CDK1-mCherry-LINuS Fusionsproteinen in den Zellkern von mit blauem Licht beleuchteten Zellen löste den Eintritt in die Mitose aus (Abb. 2A). Aufgrund von Unterschieden im Zellzyklusstadium und in der Proteinexpression zeigten zwar nicht alle Zellen eine lichtabhängige Einleitung der Mitose, jedoch war der Anteil mitotischer Zellen nach Lichtinduktion signifikant erhöht (Abb. 2B). Weitere krankheitsrelevante Signalproteine werden in Heidelberg bereits untersucht.

Synthetische Biologie als Baukasten der Forscher
Das aufstrebende Forschungsfeld Synthetische Biologie entwickelt u.A. Werkzeuge, um Zellen mit vollkommen neuen, in der Natur nicht vorkommenden Eigenschaften auszustatten. Dies erfolgt nach ingenieurswissenschaftlichen Prinzipien: Mithilfe standardisierter Bausteine (sog. BioBricks) sollen komplexe genetische Schaltkreise (sog. Devices) konstruiert werden, die gezielt in Organismen mit einer minimalen genetischen Grundausstattung (sog. Chassis) eingebaut werden. Drew Endy, ein Vorreiter der Synthetischen Biologie an der Stanford University in Kalifornien bezeichnet dieses Vorgehen als „making biology easy to engineer" [6]. Vielversprechende Anwendungsgebiete liegen im Bereich der Biomedizin, Biotechnologie und Umwelttechnik. Im letzten Jahr holten Eils, Di Ventura und Niopek mit ihrem studentischen Team beim internationalen iGEM (international genetically engineered machine-) Wettbewerb in Boston den Weltmeistertitel der Synthetischen Biologie nach Heidelberg.

Referenzen
[1] Boyden E.S. et al.: Nat. Neurosci. 9, 1263-8 (2005)
[2] Crefcoeur R.P. et al.: Nat. Commun. 4, 1779 (2013)
[3] Yang X. et al.: Mol. Biol. Cell. 15, 2419-30 (2013)
[4] Strickland D et al.: Nat. Methods. 9, 379-84 (2012)
[5] Niopek D. et al.: Nat. Commun. 5, 4404 (2014)
[6] www.openwetware.org/wiki/Endy:Research


Autoren: Julia Ritzerfeld1,
Dominik Niopek1, Roland Eils1,2
und Barbara Di Ventura2
1 Deutsches Krebsforschungszentrum
DKFZ, Heidelberg
2 Uni Heidelberg

Weitere Beiträge zum Thema: www.git-labor.de/forschung/life-sciences-und-biotechnologie
Mehr Informationen: www.openwetware.org/wiki/Endy:Research

 

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DKFZ Krebsforschungszentrum
Im Neuenheimer Feld 580
69120 Heidelberg

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