Magnetische Immunodetektion von Pflanzenpathogenen

Der mobile Pflanzendoktor

  • Abb. 1: MagnetReader mit integriertem Detektionsmesskopf und Touch-Display sowie ABICAP Immunofiltrationssäulen.Abb. 1: MagnetReader mit integriertem Detektionsmesskopf und Touch-Display sowie ABICAP Immunofiltrationssäulen.
  • Abb. 1: MagnetReader mit integriertem Detektionsmesskopf und Touch-Display sowie ABICAP Immunofiltrationssäulen.
  • Abb. 2: Schematische Darstellung der spezifischen Bindungsreaktion innerhalb der Immunofiltrationssäulen.
  • Abb. 3: Messergebnisse der magnetischen Immunodetektion (schwarze Quadrate) in Relation zur GFLV Virusprotein Konzentration, im Vergleich zum konventionellen ELISA (rote Punkte).

Die frühzeitige Identifizierung pathogenen Befalls bei Kulturpflanzen ist für Landwirte von großer Bedeutung. Derzeit existieren keine Schnelltests, die in ihrer Sensitivität vergleichbar mit einer aufwändigen Laboruntersuchung sind. Das hier vorgestellte Detektionsprinzip ermöglicht es dem Landwirt die Untersuchung seiner Pflanzen vor Ort selbst durchzuführen. Mittels magnetischer Immunofiltration und mit Hilfe eines tragbaren Lesegerätes gelingt die zuverlässige Pathogendetektion innerhalb weniger Minuten.

Einleitung

Pflanzenpathogene führen weltweit zu erheblichen Ertragsminderungen und bedeutenden ökonomischen Schäden. Studien haben ergeben, dass weltweit von Ernteverlusten in der Größenordnung von 15 % auszugehen ist, die allein durch Pathogenbefall hervorgerufen werden. Bei einzelnen Feldpflanzen kommt es aufgrund häufigen Befalls mit pilzlichen Pathogenen sogar zu deutlich höheren Ausfällen. Dabei könnten durch eine frühzeitige Erkennung und Einleiten entsprechender Gegenmaßnahmen, wie z. B. das Sprühen geeigneter Fungizide, die Verluste deutlich eingegrenzt werden.

Routinemäßige Untersuchungen von Pflanzenproben auf das Vorkommen von pathogenem Befall sind eine geeignete Strategie, um Ernteverluste durch eine frühzeitige Bekämpfung von Schädlingen zu verringern. Zum Nachweis von Pathogenen stehen derzeit verschiedene analytische Methoden zur Verfügung. Neben mikrobiologischen Verfahren kommen überwiegend serologische und molekularbiologische Labormethoden zum Einsatz.

Zusätzlich zu dem seit etwa 30 Jahren etablierten ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay) [1], ermöglichen zunehmend Polymerase- Kettenreaktion (PCR) basierte Verfahren sehr geringe Nachweisgrenzen [2]. In all diesen Fällen müssen jedoch vom Landwirt Proben genommen und an qualifizierte Analyselabore geschickt werden. Der damit verbundene Aufwand und die Kosten werden häufig von den Landwirten gescheut, so dass in der Praxis meist erst Analyselabore beauftragt werden, wenn erste Krankheitssymptome sichtbar werden.

Das Auftreten phänotypischer Symptome ist jedoch in der Regel charakteristisch für das Endstadium der Infektion, so dass es nach Abschluss der oft Tage bis Wochen dauernden Analysen bereits zu einer flächendeckenden Ausbreitung der Krankheit gekommen ist.

Hier besteht somit erheblicher Bedarf für ein sensitives Nachweisverfahren, das vom Landwirt selbst preiswert vor Ort durchgeführt werden kann und innerhalb weniger Minuten infizierte Pflanzen zweifelsfrei identifiziert.

Darüber hinaus sollte dem Landwirt anhand des Messergebnisses eine konkrete Empfehlung bezüglich eventuell erforderlicher Maßnahmen geboten werden. Das Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie (IME) in Aachen entwickelt deshalb in Zusammenarbeit mit dem Peter Grünberg Institut (PGI 8) am Forschungszentrum Jülich ein neues Detektionssystem, mit dessen Hilfe es möglich sein soll die Pflanzen direkt vor Ort auf einen pathogenen Befall zu testen. Hierfür werden magnetische Nanopartikel mit Antikörpern kombiniert eingesetzt, die eine spezifische Detektion des Pathogens ermöglichen.

Das Magn-I-tekt Detektionssystem

Dem Detektionssystem liegt die am PGI 8 entwickelte Detektionseinheit, der MagnetReader zugrunde, mit dem sich Magnetpartikel quantifizieren lassen (Abb. 1). Er funktioniert nach dem Prinzip der Frequenzmischung, wobei im Messkopf ein magnetisches Mischfeld mittels hochfrequenter und niederfrequenter Anregungsspulen erzeugt wird. Wird in dieses Mischfeld eine mit Magnetpartikeln vorbehandelte Probe gegeben, so kommt es zu einer konzentrationsabhängigen Amplitudenänderung, die mit Hilfe von Detektionsspulen gemessen und auf einem Display als Messsignal angezeigt wird [3].

Für die Immunodetektion mit diesem System ist die Anreicherung des zu detektierenden Antigens sowie die Kopplung Pathogen-spezifischer Antikörper an Magnetpartikel erforderlich. Für die Anreicherung der pflanzlichen Pathogene werden Immunofiltrationssäulen (ABICAP) eingesetzt [4]. Pathogen-spezifische Fangantikörper werden innerhalb der Matrix der Filtrationssäulen immobilisiert.

Über die so vorbereiteten Säulen wird die zu untersuchende pflanzliche Probe gegeben. Die Pathogene im Analyten werden so an die Säulenmatrix gebunden. Alle nicht gebundenen Pflanzenbestandteile werden in einem Waschschritt entfernt. Anschließend erfolgt die Zugabe eines zweiten mit Biotin funktionalisierten Pathogenspezifischen Antikörpers, der ebenfalls an die Pathogenbestandteile auf der Säule bindet. Schließlich werden spezielle Streptavidin umhüllte magnetische Nanopartikel in die Säule gegeben.

Aufgrund der sehr hohen Affinität zwischen Biotin und Streptavidin binden die Magnetpartikel spezifisch und quantitativ an die Biotingruppen der sekundären Antikörper. Die Detektion und Quantifizierung des Pathogens erfolgt abschließend indirekt über die Magnetpartikel. Durch die spezielle dreidimensionale Polyethylenmatrix ist es im Gegensatz zum herkömmlichen ELISA möglich über die große Matrixoberfläche und ein größeres Probenvolumen mehr Antigen anzureichern. Hierdurch sind höhere Sensitivitäten im Vergleich zum ELISA realisierbar. Abbildung 2 zeigt schematisch die Nachweis-spezifischen Bindungsverhältnisse innerhalb der Filtrationssäulen.

Detektion des Grapevine Fanleaf Virus

Das neue Messverfahren wird am Fraunhofer IME bereits erfolgreich für die Detektion und Quantifizierung des Grapevine Fanleaf Virus (GFLV) eingesetzt. Bei infizierten Weinstöcken kommt es zu hohen Ernteverlusten, die bis zu 80 % betragen können [5]. Für die Detektion des Virus wurden am IME spezifische Antikörper entwickelt und in Hybridomazellkultur produziert. Das oben beschriebene Nachweisverfahren wurde im Hinblick auf Detektionszeit und Sensitivität weiter optimiert. Gegenüber dem laborbasierten ELISA wurden deutlich kürzere Detektionszeiten realisiert.

Während für einen Standard-ELISA bis zu 4,5 Stunden benötigt werden lassen sich mit Hilfe der magnetischen Immunodetektion bereits nach 30 Minuten verlässliche Aussagen über den Virusbefall treffen. Die Sensitivität konnte gegenüber dem ELISA Verfahren um den Faktor 10 gesteigert werden und liefert aktuell bereits einen zuverlässigen Nachweis von unter 0,1 ng Virusprotein pro mL Probe. Hinzu kommt ein größerer linearer Detektionsbereich beim magnetischen Immunoassay, der auch bei höheren Konzentrationen eine einfache Quantifizierung erlaubt (Abb. 3).

Ausblick

Im Rahmen der weiteren Forschung ist geplant, die Geschwindigkeit und Sensitivität des Nachweises zu steigern und ihn auf eine Vielzahl von pflanzlichen Pathogenen zu erweitern. Aktuell liegt ein besonderer Schwerpunkt auf der frühzeitigen Identifizierung von pilzlichen Pathogenen. Spezifische Antikörper gegen zwei Schimmelpilzarten wurden bereits erfolgreich hergestellt. Ebenfalls im Fokus liegt die Vereinfachung der Probenaufbereitung. So soll z. B. die einfache magnetische Extrahier- und Separierbarkeit der Nanopartikel für die Anreicherung der Antigene nutzbar gemacht werden.

Außerdem soll das Lesegerät so modifiziert werden, dass es akkubetrieben direkt im Feldeinsatz verwendet werden kann. Hierzu ist eine einfache und intuitive Bedienungsführung in der Entwicklung. Dem Benutzer sollen neben der Art des Pathogens und dem Infektionsgrad zusätzlich geeignete Gegenmaßnahmen auf dem Display empfohlen werden, so dass er etwa den Einsatz von Pflanzenschutzmitteln effizient dosieren und so einer Ausbreitung von Pflanzenkrankheiten wirksam gegensteuern kann.

Referenzen

[1] Voller A. et al.: Journal of General Virology 33, 165-167 (1976)

[2] Nassuth A. et al.: Journal of Virological Methods 90, 37−49 (2000)

[3] Krause H.-J. et al.: Journal of Magnetism and Magnetic Materials 311, 436−444 (2007)

[4] Gessler F. et al.: Applied and Environmental Microbiology 71 (12), 7897−7903 (2005)

[5] Andret-Link P. et al.: Journal of Plant Pathology 86 (3):183−195 (2004)

 

Kontakt

Dr. Florian Schröper

Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie

und Angewandte Oekologie IME, Aachen

florian.schroeper@ime.fraunhofer.de

www.ime.fraunhofer.de

 

Dr. Hans-Joachim Krause

Peter Grünberg Institut (PGI 8)

Forschungszentrum Jülich GmbH

h.-j.krause@fz-juelich.de

 

Autor(en)

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IME Fraunhofer Institut - Institutsbereich Molekularbiologie
Forckenbeckstraße 6
52074 Aachen
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Telefon: +49 241 6085 0
Telefax: +49 241 6085 10000

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