Markierungsfreies Chromosomenscreening

Diagnostik auf Basis Spektroskopie

  • Abb. 1: Schematischer Aufbau der Messanordnung mit mikroskopischem Bild von Chromosom 1. Abb. 1: Schematischer Aufbau der Messanordnung mit mikroskopischem Bild von Chromosom 1.
  • Abb. 1: Schematischer Aufbau der Messanordnung mit mikroskopischem Bild von Chromosom 1.
  • Abb. 2: Darstellung der Hauptkomponenten PC1 und PC2 auf der Bildfläche mit Chromosomen 10 und 12.
  • Abb. 3: Unten: nahfeldoptische Aufnahmen eines Chromosomensatzes und eines Einzel-chromosoms. Spektren m Nanometermaßstab können entlang des Chromosoms aufgenommen werden zur spezifischen Charakterisierung sehr kleiner Sub-Strukturen des Chromosoms. Oben: Reflexionsspektren von p-Arm, q-Arm und Zentromerregion.
  • Prof. Dr. Rudolf Kessler, Leiter Prozessanalytik, Reutlingen Research Institute
  • Dipl.-Ing. (FH) Tobias Merz, wissenschaftlicher Mitarbeiter, Reutlingen Research Institute
  • LM-Chem Edwin Ostertag, wissenschaftlicher Mitarbeiter, Reutlingen Research Institute
  • M.Sc. Karsten Rebner, wissenschaftlicher Mitarbeiter, Reutlingen Research Institute

Durch spektroskopische Verfahren im Fern- und Nahfeld wird es zum ersten Mal möglich, ungefärbte Chromosomen spezifisch zu charakterisieren und erfolgreich für die Chromosomendiagnostik einzusetzen. Die Fernfeldtechnik erlaubt eine schnelle und preisgünstige Charakterisierung. Die optische Nahfeldtechnik kann Sub-Strukturen des Chromosoms im Nanometermaßstab auflösen und spektroskopisch typisieren.


Chromosomenanalysen


Chromosomenanalysen dienen zur Erkennung von erblichen Krankheiten. Abweichungen im Karyotyp wie Veränderungen der Chromosomenzahl (z.B. Trisomie 21, Monosomie X) oder strukturelle Aberrationen wie Translokation, Deletion oder Inversion können damit nachgewiesen werden. Die Diagnostik unterscheidet zwischen pränataler und postnataler Chromosomenanalyse sowie der Präimplantationsanalyse. Durch eine pränatale Karyotypisierung können Föten bereits während der Schwangerschaft auf mögliche Erkrankungen und Schädigungen untersucht werden. Insbesondere im Bereich der pränatalen Diagnostik besteht ein großer Bedarf nach einem zuverlässigen und schnellen Test zur Karyotypisierung, der auch von nicht spezialisiertem Personal durchgeführt werden kann. Seit Mitte des 20. Jahrhunderts sind Techniken im Einsatz zur Untersuchung von Chromosomen, die sich in der Metaphase der Mitose befinden. Den Stand der Technik stellen störungsanfällige, aufwändige Rasterkrafttechniken dar, sowie zeitintensive Färbetechniken, die von Färbequalität, Kondensationsgrad und Spreitung der Chromosomen abhängen. Wiederholungsfärbungen oder Doppelfärbungen sind häufig nötig, um eine Analyse zu ermöglichen und zu verifizieren. Eine bewährte Methode ist die GTG-Bänderung (G-Banden nach Trypsinierung und Giemsa-Anfärbung). Nach einer Behandlung der Chromosomen mit dem Enzym Trypsin wird der Chromatin-Komplex aus DNA und gebundenen Histonproteinen mit Hilfe von Methylenblau angefärbt. Je nach Basenzusammensetzung, Chromatinkondensation und Zeitpunkt der Replikation ergeben sich abwechselnd dunkel gefärbte Abschnitte (G-Banden) und hell gefärbte Abschnitte (R-Banden). Durch das gebänderte Profil ist beim Menschen und einigen Tieren eine eindeutige Identifizierung aller Chromosomen möglich.

Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und die spektrale Karyotypisierung (SKY) bilden weitere Verfahren zur Chromosomenanalyse basierend auf Färbetechniken [1,2].

Innovation durch markerfreie spektrale Karyotypisierung

Das markerfreie Chromosomenscreening ist ein schnelles und einfaches Verfahren zur verbesserten Chromosomenanalyse - unabhängig von Markierungs- oder Färbetechniken. Durch spektroskopische Messung der interferierenden Streueigenschaften eines Chromosomenpräparates werden die Chromosomenstrukturen chemisch und morphologisch charakterisiert. Interferenz beschreibt die Überlagerung von zwei oder mehreren Lichtwellen, wobei der Lichtstrahl an jeder Phasengrenze teilweise reflektiert und teilweise transmittiert wird. Die unterschiedlichen Längen der zurückgelegten Wege von Teilstrahlen des Lichts führen zu Gangunterschieden und damit zu relativen Phasenverschiebungen. Aus der Überlagerung der partiell reflektierten Teilstrahlen resultiert ein Interferenzeffekt. Dieser Effekt wird durch lokale Unterschiede im Brechungsindex, durch Schichtdickenvariationen oder durch eine unterschiedliche geometrische Anordnung der Streuzentren verstärkt und ist im Falle der Chromosomen sehr spezifisch. Die Detektion des Interferenzmusters erfolgt mit einem einfachen

Spektrometer z.B. im sichtbaren Wellenlängenbereich und kann deshalb sehr kostengünstig in ein Standardmikroskop eingebaut werden. Das globale Interferenzmuster (Lage des Spektrum) beschreibt die Schichtdicke. Das lokale Interferenzmuster mit seinen spezifischen Resonanzstellen erfasst die spezifische Bänderungsstruktur. Charakteristische Absorptionen und Streuleistungen je Chromosom sind verknüpft mit dessen DNA- und Protein-Anteil. Abbildung links verdeutlicht den schematischen Aufbau, daneben sind die Pushbroom-Spektren von Chromosom 1 dargestellt.

Die Spektren beinhalten neben der globalen Interferenz (Größe und Morphologie der Chromosomen) auch die lokale Interferenz (spezifische Bänderungsstruktur). Im Bild rechts die mikroskopische Abbildung von Chromosom 1 sowie dessen spektrale Informationen mit Pushbroom-Imager.
Durch die Messung der spektralen Eigenschaften wird eine Vielzahl von überlagernden Informationen erhalten. Mit Hilfe der multivariaten Datenanalyse, welche einige wenige latente Faktoren aus den vorbehandelten Spektren extrahiert, lässt sich ein Klassifizierungsmodell für die Chromosomenpaare entwickeln. Abbildung 2 zeigt die Verteilung der latenten Variablen in den Chromosomen 10 und 12. Anhand der Hauptkomponente 1 (PC1) sind keine Unterschiede zwischen den Chromosomen 10 und 12 zu sehen (aufgrund ähnlicher Größe und Morphologie). Erst die Hauptkomponente 2 (PC2) enthüllt die Unterschiede zwischen den beiden Chromosomen und erlaubt eine spektrale Klassifizierung. Diese Klassifizierung wurde durch FISH bestätigt.

Chromosomenscreening im Nahfeld

Die Beugungsbegrenzung der „normalen" Fernfeldmikroskopie beschränkt die Bandenauflösung der Chromosomenanalyse sowohl beim klassischen Giemsa-Bänderungsverfahren als auch beim hier vorgestellten Chemical-Imaging-Verfahren. Für eine höhere Bandenauflösung und eine genauere Lokalisation von Aberrationen auch in Sub-Strukturen des Chromosoms kann die Auflösung über ein optisches Nahfeldmikroskop gesteigert werden [3]. Dies wird bereits praktiziert in Kombination mit der FISH-Technik [4]. Die hier beschriebene Technik verwendet als Nahfeldsonde eine Festkörper-Immersionslinse (Solid Immersion Lens, SIL) in einem Mikrospektralphotometer [5, 6]. Mit Hilfe der SIL werden die Interferenzeigenschaften und die optischen Eigenschaften der Chromosomen mit einer hohen lateralen Auflösung gemessen. Die SIL detektiert das evaneszente Nahfeld, welches nicht dem Abbé´schen Beugungslimit unterliegt. Strukturen, die kleiner sind als die halbe Wellenlänge des Lichts, können damit diskriminiert werden. Durch den Nahfeld-Kontrast mit der SIL können somit auch ungefärbte Chromosomen abgebildet werden. Die laterale Auflösung liegt im Bereich von ≤ 30 nm. Die SIL-Technik lässt zudem das Abrastern bei unterschiedlichen Wellenlängen zu, um zusätzliche Informationen beispielsweise über den Protein- und DNA-Anteil zu erhalten. Einzelne Sub-Bänder können spektral charakterisiert werden. Auf diese Weise wird die Analyse unabhängig von der Färbequalität. Gegenüber anderen scannenden nahfeldoptischen Techniken (SNOM) bietet die Festkörper-Immersionslinse ein besseres Signal/Rausch-Verhältnis und damit eine bessere Nachweisgrenze. Die Eignung auch zur Fluoreszenz-Spektroskopie im Nahfeld ist dadurch gegeben. Abbildung 3 unten stellt nahfeldoptische Aufnahmen von Chromosomen dar. Im oberen Teil sind die Reflexionsspektren von p-Arm, q-Arm und Zentromerregion abgebildet.

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