Massenspektrometrie: Aufklärung der B-Zell-Rezeptor vermittelten Signaltransduktionskaskade

  • Abb. 2: Schema der metabolischen und chemischen Protein / Peptid-Markierung. Eine Zellkultur mit „leichtem“ Medium dient als Referenz/Kontrolle.Abb. 2: Schema der metabolischen und chemischen Protein / Peptid-Markierung. Eine Zellkultur mit „leichtem“ Medium dient als Referenz/Kontrolle.
  • Abb. 2: Schema der metabolischen und chemischen Protein / Peptid-Markierung. Eine Zellkultur mit „leichtem“ Medium dient als Referenz/Kontrolle.
  • Abb. 3: Quantitative, massenspektrometrische Bestimmung von phosphorylierten Peptiden nach Stimulation von B-Lymphozyten. A) Arbeitsablauf mit unterschiedlichen stabilen Isotopen. B) Repräsentatives quantitatives Massenspektrum (MS) eines phosphorylierten Peptides an der Aminosäure Serin (pS) des NFAT Transkriptionsfaktors. Die Menge dieses phosphorylierten Peptides steigt nach längerer Stimulation der B-Zellen an. C) Fragmentspektrum (MSMS) des phosphorylierten Peptides mit den dazugehörigen Fragmentionen. Ermittelt wurden Sequenz und das phosphorylierte Serin in der Mitte des Peptides.

Die bioanalytische Massenspektrometrie hat sich in den letzten 20 Jahren zu einer Schlüsseltechnologie in den Lebenswissenschaften entwickelt. Dies führte zur Etablierung einer neuen Forschungsrichtung, der Proteomik. Per Definition bezeichnet Proteomik die Erforschung des Proteoms, der Gesamtheit aller in einem bestimmten Zustand einer Zelle oder eines Organismus vorhandenen Proteine.

Massenspektrometrie und Proteomik

Diese Definition beinhaltet bereits eine der Herausforderungen an die moderne Massenspektrometrie, denn das Proteom einer Zelle ist nicht konstant, sondern dynamisch reguliert. Beispielsweise finden sich bei der zellulären Entwicklung, Differenzierung, Proliferation und auch in den einzelnen subzellulären Prozessen unterschiedliche Proteine in unterschiedlicher Kopienanzahl.

Die bioanalytische Massenspektrometrie ermöglicht eine die sehr schnelle und zuverlässige Proteinidentifizierung und -quantifizierung sowie die Analyse von Protein-Modifikationen. Die Entwicklungen sogenannter weicher Ionisierungstechniken wie Matrix Assisted Laser/Desorption Ionisation (MALDI) und Electrospray Ionisation (ESI) ermöglichte es, ganze Proteine und Proteinfragmente (Peptide) in der Gasphase zu ionisieren.

Die stetig zunehmende Zahl sequenzierter Genome liefert Informationen in silico über das Molekulargewicht und die Aminosäuresequenz von Proteinen und ermöglicht so den Abgleich der durch Messung mit dem Massenspektrometer erhaltenen Massen.

In einem typischen proteomischen Arbeitsablauf erfolgt die Proteinidentifizierung nicht durch die Molekulargewichtsbestimmung von intakten Proteinen, sondern deren Peptiden. Oftmals genügt der Nachweis eines einzelnen Peptides, um ein Protein verlässlich zu identifizieren. Für die Proteinspaltung werden spezifische Endoproteinasen wie Trypsin eingesetzt, die Proteine an bestimmten Aminosäuren (hier Arginin und Lysin) in Peptide hydrolysieren.

Diese Peptide werden zunächst über Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) aufgetrennt und anschließend im Massenspektrometer ionisiert. Im Gerät wird die exakte Masse der Peptide bestimmt, anschließend werden ein oder mehrere Peptide isoliert und entlang der Peptidbindung in der Gasphase fragmentiert.

Aus den akkuraten Massen der dadurch erhaltenen Fragmente, die mit den Massen der jeweiligen Aminosäuren übereinstimmen, kann das Peptid sequenziert werden.

Durch einen Datenbankabgleich der Peptidmasse und der Sequenzinformation kann schließlich das Protein identifiziert werden.

Bioanalytische Massenspektrometrie

In der bioanalytischen Massenspektrometrie werden beide oben genannten weichen Ionisierungsverfahren, MALDI und ESI, verwendet. Bei der MALDI-Massenspektrometrie erfolgt die Ionisation der Peptide in die Gasphase hinein durch Laserbestrahlung aus einer festen Phase (Matrix). Im Gegensatz dazu erfolgt die Ionisation der Peptide bei ESI aus der flüssigen Phase heraus und hat für die Proteomik den praktischen Vorteil, dass diese direkt an die HPLC gekoppelt werden kann.

Demzufolge hat in den letzten drei bis fünf Jahren, insbesondere in der Hochdurchsatz-Proteomik, die ESI-Massenspektrometrie an Bedeutung gewonnen. Die Proteomik beinhaltet nicht nur den Nachweis von Proteinen, sondern auch deren Quantifizierung, d.h. die Kopienanzahl der Proteine in den wie eingangs erwähnten unterschiedlichen Zellzuständen und den Nachweis von Proteinmodifikationen.

Letztere sind u.a. die treibende Kraft von Protein-Protein-Interaktionen in der Zelle und bestimmen die Aktivität eines Proteins und dessen Lebensdauer. Bislang galt die hochauflösende zweidimensionale (2D)-Gelelektrophorese als ein probates Mittel, um sowohl Proteine in verschiedenen zellulären Zuständen, als auch Proteinveränderungen durch z. B. posttranslationale Modifikationen (PTMs) durch unterschiedliche Färbemethoden zu visualisieren und quantifizieren.

Für quantitative Analysen können unterschiedliche zelluläre Zustände im Vergleich von Farbintensitäten gleicher Proteinpunkte im Gel verglichen werden. Hierfür werden Proteingemische zunächst mittels eines immobilisierten pH-Gradienten (IPG Streifen) anhand ihres isoelektrischen Punktes aufgetrennt. In der zweiten Dimension erfolgt die Auftrennung nach dem Molekulargewicht mit einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und die anschließende Färbung der im Gel enthaltenen Proteine.

Zur Identifizierung werden die entsprechenden angefärbten Proteinpunkte ausgeschnitten, im Gel mit Endoproteinasen verdaut und mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer analysiert. Allerdings hat sich in den letzten fünf Jahren die ESI-Massenspektrometrie sowohl für die quantitative Proteomanalyse als auch für den Nachweis von PTM-Proteinen gegenüber der MALDI-Massenspektrometrie durchgesetzt.

Dies beruht auf drei Faktoren: Erstens, der geringeren Analysenzeit mit Elektrospray ionisierter Peptide durch die direkte Koppelung der flüssigkeitschromatographischen Auftrennung mit der Messung und Identifizierung der Peptide im Massenspektrometer.

Zweitens, der Entwicklung von Markierungstechniken von Proteinen und Peptiden aus unterschiedlichen Zuständen der Zelle, die eine absolute und relative Quantifizierung der Proteine direkt im Massenspektrometer erlauben und zuletzt der stetigen technischen Weiterentwicklung von ESI-Massenspektrometern, die einen hohen Durchsatz von hochkomplexen Protein- und Peptidgemischen mit der entsprechenden Rechenkapazitäten innerhalb kürzester Zeit erlauben (Link zur Abb. 1).

Quantifizierung von Proteinen

In der auf dem neuesten Stand der Technik basierenden quantitativen Massenspektrometrie zur Analyse von Proteinen und deren Modifikationen in unterschiedlichen Zellzuständen ist derzeit folgender Arbeitsablauf etabliert: Zunächst erfolgt die Hydrolyse ganzer Gewebe, Zellen, Zellorganellen oder anderer zellulärer Kompartimente mit Endoproteinase wie Trypsin.

Die Quantifizierung von Proteinen aus unterschiedlichen Zellzuständen erfolgt dabei durch die Einführung von verschiedenen stabilen Isotopen, entweder bereits in der Zellkultur durch markierte Aminosäuren (SILAC) [1] oder, nach dem Verdau, in Peptide durch chemische Markierungsverfahren mit aminoreaktiven Reagenzien (iTRAQ [2], TMT [3], ICPL [4] oder Dimethylmarkierung [5]).

Anschließend werden dann die unterschiedlichen mit Isotopen markierten Proteine oder Peptide miteinander gemischt. Die markierten Peptide können dann im Massenspektrometer nicht nur identifiziert, sondern auch relativ zueinander quantifiziert werden, indem die Intensität des Signals zweier unterschiedlich markierter, gleicher Peptide verglichen wird (Abbildung 2).

Mit dieser Methodik ist es nicht nur möglich Proteine und Peptide zu quantifizieren, sondern auch deren modifizierte Versionen z.B. Phosphorylierungen, da solche Peptid-Modifikationen durch eine dem Molekulargewicht der Modifikation entsprechende Massenverschiebung zu erkennen sind. Allerdings ist die Identifizierung und Quantifizierung dieser Protein-Modifikationen durch die Tatsache erschwert, dass Modifikationen labil sein können und zudem meist nur substöchiometrisch an Proteinen zu finden sind.

Demzufolge müssen modifizierte Peptide vor einer quantitativen Analyse angereichert werden, so dass sie im Massenspektrometer in ausreichender Anzahl detektiert werden können. Bezüglich der Analyse von Phosphoproteinen und -peptiden wurden unterschiedliche Anreicherungstechniken etabliert, die es ermöglichen, mehrere tausend Phosphoproteine und -peptide zu identifizieren und zu quantifizieren.

Dabei werden nach oben beschriebener zellkulturbasierter Isotopenmarkierung Phosphopeptide aus einer komplexen Peptidmischung anhand ihres veränderten chemischen Verhaltens selektiv angereichert, z. B. durch starke Kationenaustauscher- Chromatographie (SCX), Titandioxid-Partikel (TiO2) oder immobilisierte Metall-Ionen Affinitätschromatographie (IMAC) selektiv angereichert [6, 7, 8, 9].

Somit können die modifizierten Peptide im Massenspektrometer in einem großen Maßstab eindeutig identifiziert und quantifiziert werden.

Besondere Anwendungen: Aufklärung der B-Zell-Rezeptor- Signaltransduktionskaskade

Unsere Arbeitsgruppe verwendet diesen Massenspektrometrie- basierten Arbeitsablauf zur Identifizierung und Quantifizierung des Phosphoproteoms (Gesamtheit aller Phosphoproteine) in B-Zellen des Immunsystems. Dabei vergleichen wir diese im unstimulierten Zustand mit solchen, deren B-Zell-Rezeptor (BZR) mit Antigenen aktiviert wurde [10] (Abb. 3).

Mit unserer Routinepräparation können wir bei Einsatz von einem Milligramm Protein vor der B-Zell-Rezeptor-Stimulation 3600 phosphorylierte Peptide identifizieren. Diese weisen 3633 phosphorylierte Stellen auf und führen zur eindeutigen Identifikation von 1694 phosphorylierten Proteinen. Nach BZR-Stimulation können darüber hinaus 46 % mehr phosphorylierte Peptide mit insgesamt 49 % mehr Phosphorylierungsstellen nachgewiesen werden.

Insgesamt lassen sich so 2187 phosphorylierte Proteine eindeutig nachweisen. Die Auswertung der Ergebnisse zeigte, dass nach BZR-Stimulation bereits bekannte Schlüsselproteine der BZR-Signalkaskaden stärker phosphoryliert werden. Des Weiteren wurden bisher noch nicht mit der BZR-Signalleitung in Verbindung gebrachte Phosphoproteine identifiziert.

Dieses Beispiel zeigt die enorme Leistungsfähigkeit einer Massenspektrometrie-basierten Proteinanalyse zur Aufklärung zellbiologischer Fragestellungen wie der, welches, die entscheidenden Schlüsselmoleküle in einer rezeptorvermittelten Signaltransduktionskaskade sind. Die hierdurch gewonnenen Erkenntnisse stellen eine wichtige Grundlage zum molekularen Verständnis der B-Zell-Biologie dar; denn sowohl die Entwicklung der B-Zellen als auch deren Aktivität im Rahmen der humoralen Immunantwort hängen in hohem Maße von der BZR-vermittelten Signaltransduktion ab.

Darüberhinaus kann eine Fehlregulation dieser BZR-Signalwege zu schwerwiegenden Erkrankungen führen. Zu diesen zählen Neoplasien wie B-Zell-Lymphome, aber auch Autoimmunerkrankungen und Immundefizienz- Syndrome.

Die Massenspektrometrie-basierte Entschlüsselung der physiologischen sowie der pathologisch dysregulierten BZR-Signalwege wird somit nicht nur zum besseren Verständnis der B-Zell-Biologie beitragen, sondern auch einen wichtigen Beitrag zur Erforschung der molekularen Pathogenese schwerwiegender Krankheitsbilder leisten.

Literatur

[1] Ong S.E. et al.: Mol. Cell. Proteomics 1 (5): 376–86 (2002)

[2] Ross P.L. et al.: Mol.Cell. Proteomics 3 (12): 1154– 69 (2004)

[3] Thompson A. et al.: Anal. Chem. 75 (8): 1895–904 (2003)

[4] Schmidt A. et al.: Proteomics 5 (1): 4–15(2005)

[5] Hsu J.L. et al.: Anal. Chem.75 (24): 6843–52 (2003)

[6] Mohammed S. et al.: Curr. Opin. Biotechnol.22 (1):9-16 (2011)

[7] Larsen M.R. et al.: Proteomics 4 (7):.873-86 (2005)

[8] Pinkse M.W. et al.: Anal.Chem.76 (14): 3935-43 (2004)

[9] Stensballe A et al.: Proteomics. 1(2):207-22 (2001)

[10] Oellerich T. et al.: Mol.Cell.Proteomics 8 (7): 1738- 50 (2009)

 

Autor(en)

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Am Faßberg 11
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