Massenspektrometrie in der Proteomik

Neueste Entwicklungen und Herausforderungen

  • Die virtuelle Konferenz ProteomicsNOW fand erstmals in diesem Jahr statt.Die virtuelle Konferenz ProteomicsNOW fand erstmals in diesem Jahr statt.
  • Die virtuelle Konferenz ProteomicsNOW fand erstmals in diesem Jahr statt.
  • Arne Kusserow.
  • Christina Poggel.

Die Proteomik hat im  Laufe des letzten Jahrzehnts eine enorme Entwicklung erfahren. Diese wurde insbesondere durch die Weiterentwicklung massenspektrometrischer Methoden vorangetrieben. In Vorträgen und zwei Interviewblöcken stellten führende Experten den neuesten Kenntnisstand in dieser Fachdisziplin und die kommenden wissenschaftlichen und technischen Herausforderungen der virtuellen Konferenz ProteomicsNOW vor.

Mit der Aufklärung von Strukturen und Wechselwirkungen der Gesamtheit der Proteine einer Zelle, des Proteoms, sind große Hoffnungen verbunden. Ein tiefergehendes Verständnis für das Zusammenspiel aller Proteine könnten Erklärungen und Behandlungsmöglichkeiten für bisher häufig unheilbare Krankheiten wie Alzheimer und Krebs liefern.

Um die enorme Komplexität des Proteoms zu erfassen, wurden immer ausgefeiltere Methoden entwickelt. Heute ist das weite Gebiet der Proteomik unterteilt in zahlreiche Unterdisziplinen. So sucht beispielweise die Strukturbiologie einen ganzheitlichen Ansatz für die Charakterisierung und die Interaktion aller in biologischen Systemen vorhandener Makromoleküle. In der medizinischen Forschung ist insbesondere die Identifizierung von Proteinen von Interesse, deren Auftreten oder Fehlen mit einer bestimmten Krankheit assoziiert ist. Im Folgenden werden wir einen Überblick über die Arbeiten von im Gebiet der Proteomik Forschenden geben und damit auf die jetzt kostenlos verfügbare Vortrags- und Interviewreihe ProteomicsNOW verweisen.

Strukturbiologie
Proteinstrukturen und deren Veränderungen bewirken und steuern nahezu alle Prozesse in lebenden Organismen. Zum Beispiel verändert die Bindung eines Hormons an „seinen“ Rezeptor seine Struktur und bewirkt so die Aktivierung einer Signalkaskade innerhalb der Zelle.
Auch Enzyme wirken über Veränderungen ihrer Struktur. Bindet ein Enzym sein Substrat, verändert es seine Form, die wiederum die Form des Substrates verändern kann, z. B. indem das Enzym sein Substrat spaltet.

Selbst die Form des gesamten Organismus wird so generiert. Kleine Proteinbausteine werden durch Enzyme miteinander zu größeren, strukturgebenden Elementen verknüpft. Die oben genannten Signalkaskaden steuern genauestens, was wohin kommt, sodass ein Körper nicht nur aufgebaut, sondern auch erhalten werden kann. So können durch Strukturveränderungen einzelner Moleküle Informationen komplexer verarbeitet und beantwortet werden, als das rein binäre Systeme vermögen. Entsprechend unübersichtlich sind diese Systeme. Die Gesamtheit solcher Veränderungen in einem System beobachten zu können ist von enormer Bedeutung für das Verständnis der Vorgänge in unserem Körper.

Um zu verstehen, wie z. B. Krebszellen entstehen, werden Techniken benötigt, die damit einhergehende Strukturveränderungen verschiedener Proteine im Zusammenhang mit äußeren Einflüssen, z. B. der Gabe eines Medikamentes, aufklären. Somit können diese Methoden einen Beitrag zum Verständnis der Krebsentstehung.

Durch neue Entwicklungen in der Analysentechnik, sowohl im Bereich der Massenspektrometrie, als auch in der Mikroskopie, können solche Untersuchungen heute an komplexen biologischen Systemen gleichzeitig durchgeführt werden. Der Aufwand und die Kosten für solche Analysen sinken und führen dazu, dass die Anzahl durchführbarer Experimente in einem Zeitraum steigt. Dadurch haben diese Technologien einen großen Einfluss auf die Medizin der Zukunft.

Tandem Mass Tags (TMTs)
In der quantitativen Proteomik spielen isobare Peptidmarkierungstechniken eine wichtige Rolle. Eine der am häufigsten angewandten Methoden ist die Verwendung von TMT-Reagenzien (tandem mass tag, TMT) in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie [1]. Für dieses Verfahren wurde im Laufe der letzten Jahre eine große Anzahl verschiedener Moleküle entwickelt, mit denen die N-Termini von Peptiden, also primäre Amine, markiert werden können [2]. Alle Varianten der TMTs basieren auf N-Hydroxysuccinimid und unterscheiden sich in der Art und Zahl von Isotopenmarkierungen. Während die auf diese Weise markierten Proteine Labels identischen Molekulargewichts aufweisen, erfolgt im Tandem-Massenspektrometer die Fragmentierung in charakteristische Verbindungen unterschiedlicher Masse. Auf diese Weise kann die relative Quantifizierung eines oder, je nach Art der eingesetzten Markierung, mehrerer verschiedener Proteine in einer Probe erfolgen.

ProteomicsNOW
Angesichts der Aufsplitterung von Forschungsgebieten in immer spezifischere Disziplinen und der damit verbundenen Bedeutung, der Fachgrenzen übergreifenden Kooperationen zukommen, wird der Bedarf nach Kommunikation zunehmend größer. Deutlich wird dies unter anderem anhand der rasanten Zunahme wissenschaftlicher Veröffentlichungen und Fachzeitschriften. Auf der Suche nach alternativen Möglichkeiten der Vernetzung zwischen Forschenden auf der ganzen Welt hat Wiley in Kooperation mit Thermo Fisher Scientific ProteomicsNOW veranstaltet. In dieser virtuellen Konferenz werden in Vorträgen und Diskussionen Forschungsergebnisse aus verschiedenen Gebieten der Proteomik, wie der Strukturbiologie und Proteinmarkierungsverfahren, und die dafür verwendeten Technologien präsentiert.

Vortragende und Vortragstitel:

  • Jesper Olsen, University of Copenhagen: TMT-multiplexed analysis for quantitative proteomics and phosphoproteomics
  • Fan Liu, Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie (FMP): Structural interactomics and its application in cell biology
  • Sandipan Ray, UCL Institute of Neurology and a visiting scientist at The Francis Crick Institute: Multipronged Quantitative Proteomics Analyses Reveal Alterations in Kinase Activities as a Fundamental Mechanism of Action of Circadian Period Altering Drugs in Mammalian Cells
  • Ryan Bomgarden, Thermo Fisher Scientific: Applications of SureQuant Pathway Panels for Quantitative Analysis of Cancer Signaling Proteins
  • Roman Fisher, University of Oxford: Proteomic Analysis of Single Cell Clusters Using Laser Capture Microdissection
  • Domitille Schvartz, University of Geneva: Plasma-derived Microparticle Biomarkers of Paracetamol-induced Hepatotoxicity
  • Bhavin Patel, Thermo Fisher Scientific: Applications of SureQuant Pathway Panels for Quantitative Analysis of Cancer Signaling Proteins
  • Aaron Robitaille, Thermo Fisher Scientific: Development of a Quality Control Standard for Tandem Mass Tags (TMT) Workflows
  • Nick Seyfried, Emory University School of Medicine: Establishing a Roadmap for Brain-based Protein Biomarkers in Alzheimer’s Disease
  • Lan Huang, University of California, Irvine: Cross-linking mass spectrometry strategies for delineating protein interactions and structures
  • Sarah Peck, University of Indiana School of Medicine: Thermal Profiling as a novel tool to analyze the impact of missense mutants on the proteome
  • Noah Dephoure, Weill Cornell Medical College: Multi-proteomic Approaches to Study the Epithelial to Mesenchymal Transition
  • Sina Ghaemmaghami, University of Rochester: Time-resolved analysis of proteome dynamics by TMT-SILAC hyperplexing
  • Terry Morgan, Oregon Health and Science University: Proteomic Analysis of Cell- and Size-Specific Extracellular Vesicles by High Resolution Flow Cytometry
  • Steve Carr, Broad Institute: Quantitative Proteomics in Biology and Medicine
  • Reid Townsend, Washington University: Battling Batch Effects in Proteomics

In Vorträgen und auch der „Panel Discussion“ werden aktuelle Forschungsarbeiten im Bereich der Strukturbiologie erläutert.
Fan Liu vom Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie stellt eine Methode vor, mit der systematisch Protein-Wechselwirkungen identifiziert werden können. Gleichzeitig werden die subzelluläre Lokalisation der Proteine, deren Konformation und Bindestellen für die Interaktion mit anderen Proteinen charakterisiert.

Lan Huang von der University of California in Irvine stellt vor, wie sie Cross-linking-Massenspektrometrie (XL-MS) als Werkzeug verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu kartieren und die Architektur großer Proteinkomplexe aufzuklären.
In einer Diskussion zur Strukturbiologie spricht James Bruce von der University of Washington über dessen Forschung im Bereich der Technologieentwicklung massenspektrometrischer Anwendungen in der Proteomik. Der Schwerpunkt liegt auf der Erforschung des Protein-Interaktoms (in Anlehnung an „Genom“).

In seinem Vortrag im Rahmen der virtuellen Konferenz stellt Jesper V. Olsen seine Arbeiten zur Methodenentwicklung massenspektrometriebasierter Proteomik und Phosphoproteomik vor. Während die Proteincharakterisierung meist eine Probenmenge im Milligrammbereich und mehrere Tage Instrumentenzeit erfordert, gelang es seiner Forschungsgruppe, etablierte Techniken wie markerfreie Quantifizierung (label free quantification, LFQ), Stabilisotopenmarkierung durch Aminosäuren in der Zellkultur (stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC) und TMT zu optimieren und damit deutlich effizienter zu gestalten.
Nick Seyfried zeigt in seiner Präsentation, wie TMT-Verfahren unter anderem in der Erforschung von Alzheimer durch die Identifizierung geeigneter Biomarker eingesetzt werden können.

Ausblick
Mit dem Event ProteomicsNOW wurden Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler aus der ganzen Welt an einen virtuellen Tisch gebracht, an dem die neuesten Forschungsergebnisse, der aktuelle Stand der Technik im Bereich massenspektrometrischer Verfahren in der Proteomik und die größten Herausforderungen diskutiert wurden. Alle Vorträge und Interviews stehen online zur Verfügung. Besondere Höhepunkte der Veranstaltung waren die beiden „Panel Discussions“, in denen die Forschenden einen authentischen Einblick in ihr jeweiliges Fachgebiet, die größten Errungenschaften, aber auch die noch zu nehmenden Hürden, geben.

Kontakt

Arne Kusserow, arne.kusserow@wiley.com

Christina Poggel, christina.poggel@wiley.com

Literatur

[1] Thompson A, Schäfer J, Kuhn K et al.: Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS, Anal. Chem.. 75, 8, 2003, 1895–1904; DOI: 10.1021/ac0262560.

[2] Jane  M.  Liu, Michael  J.  Sweredoski, Sonja  Hess: Improved 6‑Plex Tandem Mass Tags Quantification Throughput Using a Linear Ion Trap−High-Energy Collision Induced Dissociation MS3 Scan, Anal. Chem. 2016, 88, 7471−7475; DOI: 10.1021/acs.analchem.6b01067.

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