Maßgeschneiderte Enzyme

Optimierung enzymatischer Eigenschaften durch gerichtete Evolution

  • Tab. 1:  Übersicht über eine Auswahl unterschiedlicher Methoden zur Generierung von Mutantenbibliotheken.Tab. 1: Übersicht über eine Auswahl unterschiedlicher Methoden zur Generierung von Mutantenbibliotheken.
  • Tab. 1:  Übersicht über eine Auswahl unterschiedlicher Methoden zur Generierung von Mutantenbibliotheken.
  • Abb. 1: Mutation und Selektion durch PACE. Das Selektions-Plasmid (SP) mit dem gene of interest (GOI) wird durch Infektion mit einem Helferphagen in die Wirtszelle eingebracht, welche das Mutagenese-Plasmid (MP) sowie das Helfer-Plasmid (AP) enthält. Weist das durch das GOI codierte Protein enzymatische Aktivität auf, folgt die Expression des Phagengens III. Nur Helferphagen, die das Protein III tragen, sind in der Lage, weitere Wirtszellen zu infizieren.
  • Tab. 2: Übersicht über eine Auswahl unterschiedlicher Methoden zur Selektion bzw.  zum Screening von Mutantenbibliotheken.
  • Abb. 2: Screening durch CSR und fluorescence-activated cell sorting (FACS). Nach der Emulgierung einzelner E.-coli-Zellen erfolgt zunächst die Zelllyse (z.B. durch Lysozym), um T7-RNAP-Mutanten freizusetzen. Im Anschluss wird die Wasser-Öl-Emulsion auf 37 °C temperiert, so dass die Transkriptionsreaktion ablaufen kann. Hierbei wird das molecular beacon als Templat verwendet. Zum Schluss erfolgt das Auslesen der Fluoreszenz mittels FACS.
Enzyme sind in ihrer Funktion als Biokatalysatoren von großem Interesse für die pharmazeutische und chemische Industrie sowie die Biotechnologie. Für viele Prozesse ist es jedoch wünschenswert, die Stabilität gegenüber beispielsweise Temperatur, pH-Wert oder Lösungsmitteln zu erhöhen oder die Aktivität gegenüber nicht-natürlichen Substraten zu verbessern.
 
Neben dem rationalen, auf der Kenntnis der 3D-Struktur basierenden Proteindesign stehen dazu unterschiedliche Verfahren der gerichteten Evolution zur Verfügung (Tab. 1 und 2). Die evolutive Verfahrensweise basiert auf der zyklischen (iterativen) Anwendung von Mutagenese, Selektion bzw. Screening sowie Amplifikation und bietet den Vorteil, in einer relativ kurzen Zeitspanne funktional optimierte Enzyme für definierte Anwendungsgebiete zu erzeugen. Dies soll im Folgenden anhand eines exemplarischen Protokolls verdeutlicht werden.
 
Protokoll – Gerichtete Evolution der T7-RNA-Polymerase zur Erhöhung der Akzeptanz modifizierter Nucleotide
Im Hinblick auf einen zukünftigen therapeutischen oder diagnostischen Einsatz ist es notwendig, RNA-Sequenzen (z. B. siRNA oder Aptamer-RNA) in einer Hydrolyse-stabilen Form vorliegen zu haben. Da die dafür nötigen 2’-modifizierten Nucleotide schlechte Substrate der bevorzugt eingesetzten T7-RNA-Polymerase (T7-RNAP) sind, soll die Substratselektivität dieses Enzyms gegenüber methylierten Nukleotiden (2‘-OMe-dNTPs) erhöht werden (vgl. Arbeiten von Ibach et al. [1]). Dies kann z. B. in einem zweistufigen evolutiven Optimierungsverfahren erfolgen, in dem aus einer Mutantenbibliothek zunächst aktive Polymerase-Varianten mithilfe der phage-assisted continuous evolution (PACE) [2] selektiert werden, die dann in einem zweiten Schritt durch „kompartimentierte Selbstreplikation“ (CSR) [3] und fluorescence-activated cell sorting (FACS) hinsichtlich ihrer Aktivität in Anwesenheit modifizierter Nucleotide bewertet werden.
 
Schritt 1: Selektion aktiver Polymerase-Varianten mittels PACE
Die evolutive Optimierung durch PACE basiert auf der Verwendung eines kontinuierlich betriebenen Bioreaktors (Turbidostat), innerhalb dessen sich Bakterien in einem gleichbleibenden physiologischen Zustand befinden.

Diese Wirtszellen enthalten ein Mutagenese-Plasmid (MP), das durch Arabinose-induzierte Expression einer mutierten Form der 3‘-5‘-Exonuklease dnaQ926 [4] (ε-Untereinheit der DNA-Polymerase III) die Mutationsrate des GOI erhöht, sowie ein Helfer-Plasmid (AP) welches das Gen III des Bakteriophagen M13 codiert. Durch Infektion mit einem Helferphagen erhalten die Zellen schließlich ein Selektions-Plasmid (SP), welches das gene of interest (GOI; hier T7-RNAP-codierende Sequenz) trägt. Wird durch Expression des GOI eine aktive T7-RNAP-Variante erhalten, führt diese zur Transkription des pIII-Gens, zur anschließenden Expression von pIII und damit zur Infektion weiterer Wirtszellen durch den Helferphagen (Abb. 1).

 
  1. Wirtszellen (hier: E. coli S109) [2], die das Mutagenese-Plasmid (MP) sowie das Helfer-Plasmid (AP) tragen, werden in einem Turbidostaten inkubiert, bis eine Zelldichte von ca. 5 x 108 Zellen/mL erreicht ist. Im Anschluss erfolgt die Verbindung des Turbidostaten mit einem Infektionsreaktor („Lagune“; 40 mL Medium in einer 100 mL-Pyrex-Flasche).
  2. Infektion der Zellkultur in der „Lagune“ mit VCSM13-Helferphagen [2] und weitere Kultivierung bei 37 °C.
  3. Um die Mutationsrate des T7-RNAP-codierenden Gens durch die Expression der modifizierten 3‘-Exonuklease zu erhöhen, wird kontinuierlich 10-prozentige sterile L-Arabinose-Lösung zugeführt, so dass die Endkonzentration innerhalb des Lagunensystems 1 % (v/v) beträgt.
  4. Die kontinuierliche Kultivierung erfolgt über vier Tage. Währenddessen werden im 6 h-Rhythmus Proben entnommen, die durch ein Plaque-Assay [2] analysiert werden.
  5. Die resultierende Kultur sollte aktive T7-RNAP-Varianten enthalten, die anschließend hinsichtlich der gewünschten Substratspezifität selektiert werden (Schritt 2).
Schritt 2: Selektion und Screening der Mutanten-bibliothek mittels CSR
Die aus der Lagune hervorgegangene, aktive Polymerasen enthaltende Zellkultur wird mit Hilfe der kompartimentierten Selbstreplikation (CSR) [3] hinsichtlich vorhandener T7-RNAP-Varianten durchmustert, welche in der Lage sind, 2‘-O-Me-NTP als Substrate zu verwenden. Die Zellsuspension wird hierfür so stark verdünnt, dass in jedem Tropfen einer Wasser-in-Öl-Emulsion nur eine Zelle vorliegt und die Analyse einzelner Polymerase-Varianten erfolgen kann. Zur Überwachung der T7-RNAP-Aktivität wird ein Primer-Templat benutzt, das den Aufbau eines molecular beacon (MB) [1] besitzt (Abb. 2).
  1. Zur Herstellung der Wasser-in-Öl-Emulsion wird zunächst eine Ölmischung (z. B. Paraffinöl/Span 80/Tween 80/Triton X-100) [3] auf Eis gekühlt und dann in eine Spritze gefüllt.
  2. Eine weitere Spritze wird mit einer Mischung der wässrigen Transkriptionslösung (Puffer: 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 30 mM MgCl2, 10 mM DTT, 6 mM Spermidin; Templat: 0,4 µM MB-primer-template [1]; Lyse-Reagenz: 1 mg/mL Lysozym, 5x BPER; Nucleotide: je 200 µM) und der aus der Lagune resultierenden Bakterienkultur befüllt.
  3. Die beiden Spritzen werden über ein T-Stück so mit einem Kapillarsystem verbunden, dass die wässrige Phase senkrecht zur Fließrichtung der Öl-Phase eingeleitet wird und es durch Scherkräfte zum Abreißen von Tropfen der wässrigen Phase kommt [7].
  4. Die Emulsion wird für 30 Minuten auf 37 °C temperiert, um eine Polymerase-Reaktion zu ermöglichen. Durch die Transkription kann sich das molecular beacon öffnen und nach entsprechender Anregung fluoreszieren.
  5. Die Sortierung der Tropfen erfolgt mittels FACS. Dadurch können T7-RNAP-Varianten, die nicht in der Lage sind, 2‘-O-Me-NTP einzubauen, von denen getrennt werden, die einen Einbau der modifizierten Nukleotide ermöglichen.
  6. In einer anschließenden PCR können interessante T7-RNAP-Varianten vermehrt und durch Sequenzanalyse identifiziert werden
Weitere Methoden der Generierung von Mutantenbibliotheken, Selektions- und Screeningverfahren sowie entsprechende Arbeitsprotokolle sind in Brakmann et al. [11,12] und Arnold et al. [13,14] in beschrieben.
 
Autoren
Susanne Brakmann, Anne Drathen, Swantje Baluch
TU Dortmund, Fakultät für Chemie und Chemische Biologie, Dortmund, Deutschland

Literatur

[1] J. Ibach, L. Dietrich, K. R. M. Koopmans, N. Nöbel, M. Skoupi, S. Brakmann, Identification of a T7 RNA polymerase variant that permits the enzymatic synthesis of fully 2'-O-methyl-modified RNA, J. Biotechnol. 167, 287-295 (2013) – DOI: 10.1016/j.jbiotec.2013.07.005

[2] K. M. Esvelt, J. C. Carlson, D. R. Liu, A system for the continuous directed evolution of biomolecules, Nature 472, 499-503 (2011) – DOI: 10.1038/nature09929

[3] F. J. Ghadessy, J. L. Ong, P. Holliger, Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 4552–4557 (2001) – DOI: 10.1073/pnas.071052198

[4] I. J. Fijalkowska, R. M. Schaaper, Mutants in the Exo I motif of Escherichia coli dnaQ: Defective proofreading and inviability due to error catastrophe, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2856-2861 (1996)

[5] J. Speck, S. C. Stebel, K. M. Arndt, K. M. Müller, Nucleotide Exchange and Excision Technology DNA Shuffling and Directed Evolution, Methods Mol. Biol. 687, 333-344 (2011) – DOI: 10.1007/978-1-60761-944-4_24

[6] J. Bittker, B. V. Le, J. M. Liu, D. R. Liu, Directed evolution of protein enzymes using nonhomologous random recombination, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 101, 7011-7016 (2004) – DOI: 10.1073/pnas.0402202101

[7] I. Koleva, H. Rehage, Deformation and orientation dynamics of polysiloxane microcapsules in linear shear flow, Soft Matter 8, 3681-3693 (2012) – DOI: 10.1039/C2SM07182G

[8] D. S. Tawfik, A. D. Griffith, Man-made cell-like compartments for molecular evolution, Nat. Biotechnol. 16, 652–656 (1998) – DOI: 10.1038/nbt0798-652

[9] J. W. Ellefson, A. J. Meyer, R. M. Hughes, G. C. Cannon, J. S. Brodbelt, A. D. Ellington, Directed evolution of genetic parts and circuits by compartmentalized partnered replication, Nat. Biotechnol. 2014, 32, 97-101 – DOI: 10.1038/nbt.2714

[10] K. J. Yong, D. J. Scott, Rapid directed evolution of stabilized proteins with cellular high-throughput encapsulation solubilization and screening (CHESS), Biotechnol. Bioeng. 112, 438-446 (2015) – DOI: 10.1002/bit.25451

[11] S. Brakmann, K. Johnsson (Hrsg.), Directed Molecular Evolution of Proteins: Or How to Improve Enzymes for Biocatalysis, Wiley, 2002

[12] S. Brakmann, A. Schwienhorst (Hrsg.), Evolutionary Methods in Biotechnology: Clever Tricks for Directed Evolution, Wiley, 2004

[13] F. H. Arnold, G. Georgiou (Hrsg.), Directed Evolution Library Creation: Methods and Protocols, Springer, 2003

[14] F. H. Arnold, G. Georgiou (Hrsg.), Directed Enzyme Evolution Screening and Selection Methods, Springer, 2003

Kontakt
Prof. Dr. Susanne Brakmann
TU Dortmund
Fakultät für Chemie und  Chemische Biologie
Dortmund, Deutschland
susanne.brakmann@tu-dortmund.de

Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/forschung/

Autor(en)

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.