Maßgeschneiderte Hydrogele für die Kultivierung von Zellen

Besser Zelldifferenzierung und Kultivierung durch neue Materialien

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  • Abb. 1. Schema und Herstellungsschritte der Denovo Matrix Biomatrixbeschichtungen. (A) Schema der Biomatrixbildung durch Ausnutzen der nicht-kovalenten Wechselwirkung zwischen sulfatierten GAGs und Peptid-starPEG-Konjugaten. (B) Die in vivo mimetische Dünnschicht wird durch Mischen des komplexen GAG-Zuckers (gelb) mit dem synthetischen Polymer (blau) gebildet, welches zuvor chemisch mit dem biomimetischen Peptid konjugiert wurde. (C) Ein Transmissionselektronenmikroskopie-Bild der Biomatrix- Dünnschicht. Die Biomatrixbeschichtungen wurden in 96- Well-Platten vor der Fixierung in Paraffin hergestellt. Die Grenze zwischen Well-Platte, Biomatrix und Überstand wurden mit gestrichelter Linie markiert. Maßstab 100 nm.
  • Abb. 2: Denovo Matrix-Beschichtungen für die Anheftung, Ausbreitung und Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen (MSC) in osteogene Linien. (A) Experimente mit der Adhäsionssequenz RGD, welche in die Denovo Matrix-Beschichtung integriert wurde, zeigten eine verbesserte Anhaftung von MSCs auf der Plastikoberfläche. (B) Im Vergleich zum Wachstum auf Fibronektin-beschichteten Oberflächen konnte eine vergleichbare Anhaftung beobachtet werden. (C) MSCs wurden in den osteogenen Medien 21 Tage lang mit den Denovo Matrix-Beschichtungen und Fibronectin-Kontrollen differenziert. Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder zeigen Zellen, die Osteocalcin (grün) exprimieren - ein typischer Knochenmarker - auf beiden Oberflächen. (D) Die Kaziumablagerung als ein Kennzeichen der Knochenbildung wurde auf Denovo Matrix-Beschichtungen um das 3-fache erhöht. Färbung: Phalloidin-Atto633 (Aktin, rot), DAPI (Kerne, blau) und  (Osteocalcin, grün). Maßstab 60 μm.
  • Abb. 3: „Maßgeschneiderte“ Denovo Matrix-Beschichtungen zur Förderung der ProliferaDon oder neuronalen Differenzierung von neuralenVorläuferzellen (NPC). Als Kontrolle dienten Laminin-beschichtete Oberflachen. (A) Fluoreszierende Bilder von neuronalen (Map2ab, grün), differenzierten Zellen nach 8 Tagen Kultur (Kerne gefärbt mit Hoechst 33342, blau). Masstab: 50 μm. (B) Analyse der Rate von MAP2ab-posiUven Zellen in Bezug auf die Gesamtzellzahlen

Neue Biomaterialien für den Einsatz in der Zellkultur sind dringend erforderlich. Die hier vorgestellte Arbeit hat zum Ziel, die natürliche Zellumgebung so exakt wie möglich in der Kulturschale nachzubauen, um zukünftig auch nicht oder nur schwer kultivierbare Zelllinien einfach und kostengünstiger als bisher im Labor anwenden zu können und dabei die altbewährte Methode der Zellkultur zu revolutionieren.

Die Kultivierung von biologischen Zellen ist eine Standardmethode weltweit und wird als vereinfachtes Modell verwendet, um die natürlichen und pathologischen Prozesse im menschlichen Organismus nachzubilden und besser zu verstehen, um daraus neue Therapieansätze abzuleiten. Allerdings verwenden Wissenschaftler oftmals noch immer physiologisch wenig relevante Plastikoberflächen, auf denen sie ihre Zellen kultivieren. Die so gewonnenen Erkenntnisse repräsentieren häufig nicht das, was tatsächlich im Organismus passiert. Deshalb können Forschungsergebnisse, die im Zellversuch gewonnen worden, oftmals nicht von der Laborbank in die Klinik („from bench to bedside“) überführt werden. Das ist einer der Hauptgründe für die immensen Kosten ist, um ein neues Medikament auf den Markt zu bringen.

Spezifische, biologisch relevante Zellumgebung für jeden Zelltyp

Um das zu ändern wurde eine Produktplattform entwickelt, mit der es möglich ist, für jeden Zelltyp die spezifische, biologisch relevante Zellumgebung bereitzustellen. Die Produkte basieren auf natürlich vorkommenden Einzelkomponenten der extrazellulären Matrix, die modular und chemisch definiert als einfach anzuwendendes Biomaterial zusammengesetzt werden können. Dabei wird 4-Arm-Polyethylenglycol (starPEG) als Gerüstsubstanz verwendet, in die natürliche Zuckermoleküle (Glukosaminoglykane, GAGs) und wichtige Peptid-Signalmoleküle integriert werden. Die Herstellung der nicht-kovalenten Biomatrices erfolgt innerhalb weniger Minuten über eine einfache, selbst-organisierende Flüssig-Flüssig-Phasenseparierung, der so genannten Koazervation und der anschließenden Gelierung durch die Interaktion der im millimolaren Konzentrationsbereich eingesetzten GAGs und der Peptide (Abb. 1).

Dabei entstehen Ultradünnschicht-Beschichtungen, die aus verschiedensten GAGs und Peptidsequenzen zusammengesetzt sein können.

Kombinatorischer Screeningansatz

Die individuell zusammengestellten Biomaterialkombinationen wurden als Bibliothek dann zur Beschichtung von 96-Standard-Lochplatten-Plastikzellkulturträgern verwendet. Darauf wurden anschließend die Zellen in einem kombinatorischen Screeningansatz kultiviert und analysiert, um dabei die Materialkombination zu identifizieren, auf denen die Zellen am besten wachsen, d.h. wo sie am besten anhaften und sich flach ausbreiten. Kombinatorisches Screening ist eine vielversprechende Methode, um neue Biomaterialien für maßgeschneiderte Zellkulturanwendungen zu identifizieren. Dazu gibt es bereits verschiedene Ansätze, bei denen Biomaterialbibliotheken mit verschiedenen biochemischen Eigenschaften entwickelt wurden. Im Gegensatz zu dem hier vorgestellten Material implementiert allerdings keine davon gleichzeitig neben den biochemischen auch physikalische Eigenschaften sowie die dynamischen Veränderungen der natürlich vorkommenden extrazellulären Matrix.

In Screeningansätzen konnten bereits für fünf verschiedene Zelltypen definierte Biomatrixkombinationen identifiziert werden, auf denen die Zellen besser anhaften. Dazu gehören unter anderen mesenchymale Stammzellen (MSC), menschliche Zervixkarzinom-Epithelzellen (HeLa), humane Glioblastom-Zellen (U-251 MG), humane Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) sowie neonatale sowie humane Hautfibroblasten (HDF).

Zelldifferenzierung verbessern

Neben der verbesserten Anhaftung, eignen sich die neuartigen Oberflächen aber auch für andere Anwendungen. Für MSCs konnte beispielsweise gezeigt werden, dass sie bis zu dreimal mehr des Knochenmarkers Osteokalzin produzieren, wenn sie auf mit der neuen Matrix beschichteten Oberflächen anstatt auf dem gegenwärtigen Standard Fibronectin gezüchtet wurden (Abb. 2). Damit unterstützt das Material die osteogene Differenzierung der Stammzellen und trägt so zu einer funktionellen Verbesserung der Zellen bei. MSCs werden bereits heute für die Behandlung der Graft-versus-Host-Krankheit nach Knochenmarkstransplantationen eingesetzt und werden in der Zukunft auch eine Rolle bei der Behandlung von Knochen- und Knorpelerkrankungen spielen.

Ein funktioneller Einfluss des Materials konnte auch für neurale Vorläuferzellen gezeigt werden. Während sich NPCs auf einer bestimmten Biomaterialzusammensetzung optimal vermehren, benötigen sie eine alternative Umgebung, um zu Neuronen oder Astrozyten zu differenzieren. So kann man anhand des „Maßschneiderns“ des richtigen Materials zum einen genügend Vorläuferzellen anwachsen lassen und zum anderen qualitativ optimierte Nervenzellen für deren Anwendung beispielsweise in der Medikamentenforschung oder auch für den zukünftigen klinischen Einsatz generieren. Für NPCs wurde schon von anderen Gruppen gezeigt, dass die Zusammensetzung der Nischen-ECM einen erheblichen Einfluss auf deren Verhalten hat und dass dabei in allen Entwicklungsstadien insbesondere Glykosaminoglykane (GAGs) eine wichtige Rolle spielen. Basierend darauf wurden verschiedene Kompositionen getestet und konnte bspw. für Heparin-Oberflächen gezeigt werden, dass NPCs darauf eine bis zu dreimal so hohe Überlebensrate haben wie auf den derzeitigen Standard-Laminin-beschichten Oberflächen, und dabei bis zu 20fach effektiver zu Neuronen differenzieren (Abb. 3).

Fazit

Die neuartigen Beschichtungen können also je nach Zusammensetzung das Zellwachstum sowohl quantitativ als auch qualitativ beeinflussen, indem Komponenten der ECM integriert werden und so die artifizielle Zellkulturumgebung besser an die natürliche Umgebung der Zellen im Körper angepasst wird. Gegenwärtig gibt es neben verschiedenen Laminin- oder Kollagenbeschichtungen vor allem einen natürlicher Basalmembranextrakt aus Maustumorgewebe der mehrere Nischenkomponenten verkörpert. Seine genaue Zusammensetzung ist jedoch unbekannt. Darüber hinaus vereint keines der gegenwärtigen Produkte gleichzeitig die Fähigkeiten, modular spezifische Komponenten individuell und chemisch definiert so auszuwählen, dass es an die Bedürfnisse des jeweiligen Zelltyps angepasst ist.

Ausblick

Im Team kombinieren Chemiker, Pharmazeuten, Zellbiologen und Wirtschaftswissenschaftler ihre Expertise und validieren gegenwärtig verschiedenste Molekülkombinationen für verschiedene Zelltypen in einem vom Bundesministerium für Wirtschaft und Energie geförderten Exist-Forschungstransfer-Projekt. Darüber hinaus wird an weiteren potentiellen Anwendungsgebieten für das Biomaterial gearbeitet.

Autoren
Nadine Schmieder-Galfe1 und Dejan Husman1

Zugehörigkeit
1 Team denovoMATRIX am ZIK BCUBE der Technischen Universität Dresden, Dresden, Deutschland

Kontakt
Dejan Husman

Team denovoMATRIX
ZIK BCUBE der Technischen Universität Dresden
Dresden, Deutschland
dejan.husman@tu-dresden.de
www.denovomatrix.com

Referenzen

Originalpublikation
Robert Wieduwild, Richard Wetzel, Dejan Husman, Sophie Bauer, Iman El‐Sayed, Sarah Duin, Priyanka Murawala, Alvin Kuriakose Thomas, Manja Wobus, Martin Bornhäuser, Yixin Zhang. Coacervation‐Mediated Combinatorial Synthesis of Biomatrices for Stem Cell Culture and Directed Differentiation. Advanced Materials. 2018, in press. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Reproduced with permission.

[1] Wieduwild R. et. al. J. Am. Chem. Soc., 135(8), 2919, 2013
[2] Wieduwild R. et. al. Biomacromolecules, 15(6), 2058, 2014
[3] Wieduwild R. et. al. Anew. Chem. Int. Ed., 54(13), 3962, 2015
[4] Tondera C., et. al. Adv. Func. Mat., DOI: 10.1002/adfm.201605189
[5] Wieduwild R. et. al. Adv. Mat., 2018, in press.

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