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Quantitative Visualisierung der Saccharose-Verteilung in Pflanzen

  • Abb.: Quantitative Karte der Saccharose-Verteilung in einem sich entwickelnden Gerstenkorn aufgenommen mit FTIR-Mikrospektroskopie. Rote (blaue) Farbwerte entsprechen maximaler (minimaler) Konzentration von Saccharose. Schema im linken Bildabschnitt zeigt wie Saccharose in das Korn gelangt.Abb.: Quantitative Karte der Saccharose-Verteilung in einem sich entwickelnden Gerstenkorn aufgenommen mit FTIR-Mikrospektroskopie. Rote (blaue) Farbwerte entsprechen maximaler (minimaler) Konzentration von Saccharose. Schema im linken Bildabschnitt zeigt wie Saccharose in das Korn gelangt.

Saccharose ist die wichtigste Transportform von Zuckern in Pflanzen, die Hauptenergiequelle und ein Signalgeber bei Stress. Analytische Standardverfahren können die Menge an Saccharose exakt bestimmen, jedoch nur, wenn die Zellen und das Gewebe in einem Extraktionsverfahren zerstört werden. Fortschritte in der Infrarotspektroskopie (IR-Spektroskopie) ermöglichen nunmehr eine quantitative Visualisierung der Saccharose-Verteilung mit mikroskopischer Auflösung. Dieses neue Präzisionswerkzeug eröffnet Forschern und Pflanzenzüchtern vielfältige Möglichkeiten.

Saccharose, auch als Rohr- oder Rübenzucker bezeichnet, beeinflusst aufgrund ihrer elementaren Aufgaben sämtliche Wachstums- und Entwicklungsprozesse. Forscher entwickeln daher immer wieder neue Messverfahren, um die Mengen dieses Disaccharids in Geweben zuverlässig und schnell bestimmen zu können. Jedoch, keine der gängigen Methoden erlaubt es, die Saccharose-Verteilung im Gewebe zu visualisieren und gleichzeitig zu quantifizieren. Genau dies wäre jedoch notwendig, um Aussagen zum Zuckertransport, zur Speicheraktivität und Ertragsbildung bei Kulturpflanzen wie Gerste, Weizen oder Raps zu treffen.
 
IR-Fingerabdruck von Saccharose
Bisherige bildgebende Verfahren für die Kartierung von Saccharose sind entweder nicht quantitativ, zu unspezifisch oder verlangen gar eine gentechnische Veränderung der zu untersuchenden Pflanze, was für die Anwendung bei Kulturpflanzen problematisch wäre. Basierend auf IR-Spektroskopie wurde jetzt ein neuer Lösungsansatz entwickelt. Dabei wird die Probe in gefrorenem Zustand in mikroskopisch dünne Scheiben (~10 µm) zerschnitten und mit einem IR-Mikroskop vermessen [1]. Es ist seit langem bekannt, dass Mittel-IR-Strahlung zu spezifischen Schwingungen im Saccharose-Molekül führt. Im resultierenden IR-Spektrum wird dadurch ein charakteristischer „Fingerabdruck“ erzeugt. Die Kunst war es nun, diesen Fingerabdruck aus den übrigen Signalen und insgesamt sehr komplexen Fourier-transformierten (FT) Spektren herauszufiltern. Dies gelang unter anderem durch die Einführung einer internen Standardisierung, welche analog zu chromatografischen Verfahren die Messergebnisse Chargen-unabhängig, vergleichbarer und besser quantifizierbar macht.

Nach Basislinienkorrektur und Vergleichen mit Standardspektren entsteht so ein mathematisches Modell, welches mit einer Genauigkeit von mindestens 90 % die Saccharose-Verteilung im beobachteten Gewebeabschnitt abbildet. Der quantifizierbare Bereich umspannt 20-1000 mM, also biologisch äußerst relevante Konzentrationen. Die räumliche Auflösung des Verfahrens wird ganz wesentlich von dem verwendeten Objektiv am IR-Mikroskop bestimmt und lässt sich von zurzeit 12 µm weiter steigern. Wichtig bei analytischen Verfahren ist natürlich auch der Arbeitsaufwand und erreichbare Probendurchsatz. Je nach Komplexität des Gewebes und Auflösung dauert die Erstellung einer quantitativen Saccharose-Karte zwei bis sechs Stunden – weitere Optimierungen sind möglich.

 
Was kann man mit der neuen FTIR-Methode sehen?
Zunächst sollte die Saccharose-Verteilung in Gerstenblättern erstmals visualisiert werden. Diese Analysen zeigten, dass Saccharose in den Leitbahnen (Phloem) um ein Vielfaches höher konzentriert war als in den umliegenden Blattgeweben (Mesophyll). Diese Aufkonzentrierung wird durch spezifische Transportproteine vermittelt und führt im Falle von Gerste zu mittleren Saccharosemengen von etwa 0,3 pg µm-2 im Phloemgewebe, was Konzentrationen um die 45 mM entspricht [1]. Die systematische Analyse sämtlicher Phloembahnen von Blatt und Stängel zeigte, dass diese Konzentration beträchtlichen Schwankungen unterliegt. Dies war unerwartet, ging man doch bisher davon aus, dass alle Phloembahnen ein Kontinuum darstellen. Offensichtlich gibt es noch unbekannte Mechanismen, welche den Saccharose-Transport beeinflussen und erforscht werden müssen. Von Blatt und Stängel wird der Zucker über eine zentrale Vene in die sich entwickelnden Körner transportiert (Abb. linke Bildseite). Wie die Saccharose-Karte (rechte Bildseite) eines Korns zeigt, akkumuliert Saccharose im ventralen Teil, wo sich auch die Vene befindet und Entladungsprozesse stattfinden [2]. Von hier fließt die Saccharose entlang einem Konzentrationsgradienten in Richtung Endosperm (dies entspricht dem im Inneren des Korns gelegenen Stärkespeichergewebe). Unsere räumlich hochauflösenden Saccharose-Karten zeigen hier eine weitere Besonderheit: im Bereich der Transferzellschichten kommt es zu einer lokalen Anreicherung der Saccharose. Verantwortlich hierfür sind wahrscheinlich wiederum spezifische Transportproteine, welche, durch Protonenpumpen aktiviert, Saccharose in das Endosperm „pumpen“. Die neue FTIR-Methode konnte diese nur aus wenigen Zellschichten bestehende Region als besonders aktive Zone identifizieren. Die Visualisierung solch kleinräumiger Transportregionen ist besonders interessant und mit bisherigen Methoden kaum darstellbar.
Die FTIR-Methode kann auch aufzeigen, was passiert, wenn spezifische Transportproteine nicht mehr vorhanden sind. Exemplarisch wurde dies an der Modellpflanze Arabidopsis thaliana demonstriert: wenn Mitglieder der Sweets-Genfamilie mutiert werden, führt dies zu charakteristischen Änderungen der Saccharoseverteilung im Wurzelbereich [3]. Dies hat vielfache Auswirkungen auf das Wachstum, den Stoffwechsel und die Abwehr von Pathogenen der Pflanze.
 
Fazit
Das neue FTIR-Verfahren bietet vielfältige Einsatzmöglichkeiten für Forscher und Unternehmen. Pflanzenforscher können nun mit dem standardisierten Verfahren die Saccharose-Konzentration in verschiedensten Geweben, einschließlich der Leitungsbahnen, der Pflanze systematisch vermessen. Derartige Messungen sind ein Indikator für die Wuchskraft der Pflanze, was nicht zuletzt bei der Züchtung neuer, ertragreicher Sorten von Bedeutung ist. Das Verfahren ist nicht auf Saccharose beschränkt, sondern lässt sich für die Analyse anderer Inhaltsstoffe weiterentwickeln. So erfolgte mittels der FTIR-Methode bereits eine Kartierung von Raffinose (ein Dreifachzucker) und Stärke in Öl- und Getreidesaaten [4,1]. Prinzipiell lassen sich viele Inhaltsstoffe mittels FTIR bestimmen, so lange sie eine ausreichend starke Wechselwirkung mit der IR-Strahlung zeigen.
 
Autoren
André Gündel1, Hardy Rolletschek1, Steffen Wagner1, Aleksandra Muszynska1, Ljudmilla Borisjuk1
 
Zugehörigkeit
1Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK), Abteilung Molekulare Genetik, Arbeitsgruppe Assimillokation und NMR, Seeland-Gatersleben, Deutschland

 

Kontakt 
Dr. Hardy Rolletschek
Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK)
rollet@ipk-gatersleben.de

 

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Literatur:

[1] André Guendel, Hardy Rolletschek, Steffen Wagner, Aleksandra Muszynska, Ljudmilla Borisjuk (2018). Micro Imaging Displays the Sucrose Landscape within and along Its Allocation Pathways. Plant Physiology 178 (4): 1448-1460.

[2] Melkus G, Rolletschek H, Fuchs J, Radchuk V, Grafahrend-Belau E, Sreenivasulu N, Rutten T, Weier D, Heinzel N, Schreiber F, Altmann T, Jakob P, Borisjuk L. (2011). Dynamic 13C/1H NMR imaging uncovers sugar allocation in the living seed. Plant Biotechnology Journal 9: 1022-1037.

[3] Walerowski P, Gündel A, Yahaya N, Truman W, Sobczak M, Olszak M, Rolfe SA, Borisjuk L, Malinowski R. (2019) Clubroot disease stimulates early steps of phloem differentiation and recruits SWEET sucrose transporters within developing galls. Plant Cell 30: 3058–3073.

[4] Munz E, Rolletschek H, Oeltze-Jafra S, Fuchs J, Guendel A, Neuberger T, Ortleb S, Jakob PM, Borisjuk L. (2017). A functional imaging study of germinating oilseed rapeseed. New Phytologist 216(4):1181-1190.

Kontaktieren

Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK)


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