Mesenchymale Stroma Zellen (MSC) aus Nabelschnurgewebe

Zellen mit Potential für Tissue Engineering Anwendungen

  • © dacarlo / photocase© dacarlo / photocase
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  • Abb. 1: Isolierung von MSCs aus dem Nabelschnurgewebe. (A) Querschnitt der Nabelschnur (B) Zerkleinern des Nabelschnurgewebes (C) Gewebestückchen (D) aus einem Gewebestückchen auswachsende Zellen
  • Abb. 2: Beispielhaftes Ergebnis der durchflusszytometrischen Oberflächenmarkeranalysen
  • Abb. 3: Differenzierungspotential der isolierten MSC. (A) Osteogene Differenzierung in Form eines Bone Nodules (B) Chondrogene Differenzierung. (Alcian Blau Färbung) (C) Adipogene Differenzierung (Oil Rot O Färbung).
  • Abb. 4: Vergleich der durch „Counter flow Centrifugation Elutriation“ gewonnen Zellfraktionen. Die einzelnen Fraktionen (A, B, C) weisen deutliche Unterschiede in Morphologie, Größe und Anteil seneszenter Zellen (blaue Färbung) auf.
  • Privatdozentin Dr. Cornelia Kasper, Arbeitsgruppenleiterin , Institut für Technische Chemie, Leibniz Universität Hannover
  • Prof. Dr. rer. nat. Ralf Hass, AG Biochemie und Tumorbiologie Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe, Medizinische Hochschule Hannover
  • Links: M.Sc. Pierre Moretti, rechts: M.Sc. Tim Hatlapatka, beide Wissenschaftliche Mitarbeiter am Institut für Technische Chemie, Leibniz Universität Hannover

Mesenchymale Stamm- oder Stromazellen (MSC) sind von großem Interesse für Anwendungen bei zellbasierten Therapien und im Bereich der Geweberekonstruktion, dem Tissue Engineering. Sie werden üblicherweise aus dem Knochenmark gewonnen, es konnte aber gezeigt werden, dass auch eine Vielzahl anderer Gewebe MSCs beherbergen. Vor allem die Nabelschnur ist eine vielversprechende Quelle für multipotente MSCs.

Mesenchymale Stamm- bzw. Stromazellen

Das Interesse an adulten Stammzellen und besonders an mesenchymalen Stamm- oder Stromazellen (MSC) ist seit ihrer ersten Beschreibung durch Friedenstein und Kollegen vor gut 40 Jahren stetig gewachsen [1]. Da diese Zellen verhältnismäßig leicht zugänglich sind, ein hohes Proliferationspotential aufweisen und in unterschiedliche Gewebearten differenziert werden können, sind sie besonders für den Einsatz in zellbasierten Therapien und im Bereich des Tissue Engineerings interessant. Heutzutage stellt das Knochenmark immer noch die wichtigste Quelle für MSCs dar. Allerdings ist das Vorkommen der Zellen hier relativ gering. Hinzu kommt, dass die Qualität der Zellen von Spender zu Spender variiert und mit dem Alter des Spenders abnimmt. Außerdem ist die Entnahme des Zellmaterials eine invasive und durchaus schmerzhafte Prozedur, die auch Komplikationen wie z.B. Infektionen nach sich ziehen kann.

Daher wurden vermehrt Untersuchungen angestellt, um alternative Quellen für MSCs zu finden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass MSCs in einer Vielzahl von Gewebearten vorkommen. Um hierbei eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu ermöglichen, hat das Komitee der „International Society for Cellular Therapy (ISCT)" 2006 Minimalkriterien zur Definition von MSCs vorgeschlagen. Diese beinhalten, dass MSCs plastikadhärent wachsen, eine fibroblastenähnliche Morphologie aufweisen, ein Set typischer Oberflächenmarker aufweisen und gezielt in die osteogene, sowie adipogene und chondrogene Richtung differenziert werden können [2].

Neben dem Fettgewebe hat sich vor allem das Nabelschnurgewebe als besonders viel versprechende Quellen herausgestellt [3]. Verglichen mit dem Knochenmark, ist die Anzahl an MSCs im Nabelschnurgewebe deutlich größer.

Hinzu kommt, dass das Zellmaterial sehr jung ist, da die Zellen unmittelbar nach der Geburt isoliert werden und somit primitive Eigenschaften aufweisen. Die Zellen zeigen ein gesteigertes Proliferationspotential und können ebenfalls in verschiedene Richtungen differenziert werden. Da die Nabelschnur üblicherweise nach der Geburt entsorgt wird, handelt es sich hierbei um eine Quelle, die in großem Maße vorhanden ist und ohne ethische Bedenken verarbeitet werden kann.

Isolierung von MSCs aus dem Nabelschnurgewebe

Die Nabelschnur entwickelt sich während der fünften Woche der Schwangerschaft und wächst auf eine Länge von ca. 60-65 cm heran. Am Ende der Schwangerschaft wiegt sie ca. 40 g und hat einen Durchmesser von 1,5 cm. Die Nabelschnur beinhaltet üblicherweise zwei Arterien und eine Vene, die in einem mucoiden Bindegewebe, dem so genannten Wharton's Jelly, eingebettet sind, welches nach außen hin durch ein Epithel abgeschlossen wird (Abbildung 1(A)). Zur Isolierung von MSCs aus der Nabelschnur, wird diese zunächst gewaschen, dann in ca. 10-15 cm lange Teile geschnitten und anschließend in ca. 1 cm³ große Stückchen zerteilt. Diese werden schließlich in ein Kulturgefäß überführt und in einem geeigneten Kulturmedium im Brutschrank als Explantatkultur inkubiert. Durch regelmäßiges Wechseln des Mediums werden alle nicht-adhärenten Zellen (z.B. restlich Erythrozyten) entfernt und nach etwa 10 Tagen in Kultur kann ein Herauswachsen erster Zellen beobachtet werden. Nach 14 Tagen werden die Gewebestückchen entfernt, die adhärent wachsenden MSCs können dann mit üblichen Zellkulturmethoden subkultiviert werden (Abbildungen 1 (B-D)). Sie zeigen ein hohes Proliferationspotential mit Verdopplungszeiten von weniger als 30 Stunden und können problemlos kryokonserviert und revitalisiert werden. Somit ist es möglich innerhalb kurzer Zeit Zellbänke mit ausreichend Zellmaterial für klinische Anwendungen anzulegen. Durchflusszytometrische Oberflächenmarkeranalysen zeigen, dass die Zellen die Minimalkriterien der ISCT erfüllen. Die Zellen sind positiv für die Moleküle SH2 (CD105), SH3 (CD73) und Thy-1 (CD90) (Abbildung 5). Da diese Moleküle aber ebenfalls auf den Oberflächen von hämatopoetischen, sowie Endothelzellen vorhanden sind und diese Zellen typische Kontaminationen bei der Isolierung von MSCs aus dem Nabelschnurgewebe darstellen, muss das Vorhandensein dieser Zellen anhand der Marker CD45, CD34 und CD31 ausgeschlossen werden. Dies kann ebenfalls für die so isolierten Zellen gezeigt werden. Durch die Wahl entsprechender Kultivierungsbedingungen können die Zellen gezielt in die osteogene, chondrogene und adipogene Richtung differenziert werden, was die Zellen besonders für klinische Anwendungen interessant macht. Eine osteogene Differenzierung äußert sich hierbei durch eine Calzifizierung der extrazellulären Matrix. In der Kultur können dabei häufig kleine Mineralisierungszentren, sog. „bone nodules", beobachtet werden. Durch entsprechende Nachweismethoden, wie z.B. die Alizarin Rot oder die von Kossa Färbung, können Calciumeinlagerungen gezielt nachgewiesen werden. Chondrozyten spielen eine zentrale Rolle bei der Heilung von Knorpeldefekten und stehen daher im Fokus des Knorpel-Tissue Engineerings. Untersuchungen zur Chondrozytenentwicklung und deren zugrunde liegenden Mechanismen stellen damit einen zentralen Punkt der Forschungsarbeiten dar. Eine chondrogene Differenzierung der Zellen geht einher mit einer Expression von Kollagen-II und der Bildung knorpeltypischer Proteoglykane in der extrazellulären Matrix.

Eine übliche Nachweismethode stellt hier die Alcianblau Färbung dar. Adipozyten spielen eine entscheidende Rolle als Energiespeicher und bei der Regulierung des menschlichen Stoffwechsels. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Adipozyten bei verschiedenen Krankheiten, wie z.B. Typ-I Diabetes, eine entscheidende Rolle spielen. Daher können Untersuchungen zum Reifungsprozess dieser Zellen und dessen Regulierung zum weiteren Verständnis diverser Krankheiten beitragen. Die adipogene Differenzierung der Zellen beginnt mit der Bildung intrazellulärer kleiner Neutrallipidtröpfchen, die im Laufe des Reifungsprozesses zu einer großen Vakuole verschmelzen können. Diese Neutrallipide können zum Nachweis der Differenzierung mittels Oilrot O spezifisch angefärbt werden.

Für einen effizienten Einsatz der Zellen für Tissue Engineering Anwendungen muss weiterhin noch untersucht werden, in wie fern es sich bei der isolierten Zellpopulation um eine heterogene Population handelt. So konnten beispielsweise in MSC Kulturen aus dem Nabelschnurgewebe Zellen unterschiedlicher Morphologie beobachtet werden. Dabei enthielten die Kulturen einerseits kleine Zellen (kleines Verhältnis von Zytoplasma zu Nukleus), andererseits aber auch deutlich größere Zellen. Daraufhin wurden die Zellen mittels „Counter flow Centrifugal Elutriation" (CCE) auf Grund ihrer Größe in einzelne Fraktionen unterteilt, die deutliche Unterschiede in ihrem Proliferationspotential und den Anteil seneszenter Zellen zeigten (Abb. 4) [4]. So könnte die Methode der CCE in Zukunft dafür genutzt werden, um qualitativ hochwertige Zellen für klinische Anwendungen zu liefern.

Des Weiteren gibt es immer mehr Hinweise dafür, dass die Subpopulationen innerhalb des Nabelschnurgewebes unterschiedliche Differenzierungspotentiale aufweisen [5]. Für einen effizienten Einsatz der Zellen für Tissue Engineering Anwendungen sollten die beschriebenen Subpopulationen noch detaillierter untersucht werden.

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