Minimalinvasive Gewinnung von mRNA

Verwendung einer Zytologiebürste bei endoskopischen Routineeingriffen

  • Abb. 1: Verwendete Zytologiebürste in  Relation zu einer 1 Cent Münze.Abb. 1: Verwendete Zytologiebürste in Relation zu einer 1 Cent Münze.
  • Abb. 1: Verwendete Zytologiebürste in  Relation zu einer 1 Cent Münze.
  • Abb. 2: Gewonnene mRNA-Menge pro Zytologiebürste.
  • Abb. 3: GSTM1-Expression im Tumor (T) und im makroskopisch unauffälligen Kontrollgewebe des gleichen Patienten (K) (semiquantitative PCR); RNA Menge: 200 ng. Gelber Pfeil: gesundes Gewebe, roter Pfeil: Tumorgewebe.

In der Grundlagenforschung, aber auch zunehmend in der Klinik, ist die Untersuchung von Geweben mit molekularbiologischen Methoden von entscheidender Bedeutung. Dies betrifft sowohl die Frage des Vorhandenseins bestimmter Gene in einem Tumor als auch zunehmend technisch anspruchsvollere Untersuchungen wie z. B. die Frage der Expression von Genen in aus medizinischen Gründen entnommenen Gewebeproben oder das Gewinnen vitaler Zellen von normalem Gewebe für die Grundlagenforschung. Letzteres sollte den Patienten naturgemäß so wenig wie möglich belasten.

Die Genexpression muss im Zielgewebe untersucht werden. Der Goldstandard zur Asservierung von vitalem Gewebe für spätere Protein- oder biomolekulare Analysen ist die Lagerung in flüssigem Stickstoff [1]. Normalerweise ist diese in der täglichen medizinischen Routine, außer in einigen hoch qualifizierten Tumor-Zentren, bedingt durch den technischen Aufwand, nicht durchführbar [2].

Die Gewinnung und Lagerung von vitalen Gewebeproben aus Organen, welche mittels endoskopischer Technik untersucht werden können, wie der Harntrakt, der Gastrointestinaltrakt oder die Lunge, ist besonders interessant, weil zur Gewinnung der Proben im Rahmen einer endoskopischen Routineuntersuchung nur ein wenig invasiver Eingriff durchgeführt werden muss und, das ist von besonderer Bedeutung, die Proben aus makroskopisch tumorverdächtigen Gebieten oder, wie in der vorgestellten Arbeit [3], auch aus nicht tumorverdächtigem Gewebe entnommen werden können.

Urologen haben eine lange Tradition in der Anwendung von Zytologiebürsten zur Untersuchung von klinisch oder radiologisch auffälligen Befunden im Nierenbecken oder in den Harnleitern [4,5].

Da mittels mRNA bestimmbare Expressionsmuster von Genen im Laufe der letzten Jahre zunehmend auch aufgrund der zunehmend besseren technischen Möglichkeiten an Bedeutung gewonnen haben, ist es sinnvoll eine Methode zu entwickeln, die es auch ohne Vorhaltung von flüssigem Stickstoff erlaubt, mRNA im Urothel zu bestimmen [3].

Genotypisierung versus Phänotypisierung

Die Genotypisierung hat aufgrund der Möglichkeiten der modernen molekularbiologischen Untersuchungstechniken und des gleichzeitigen Verfalls der Laborkosten für die entsprechenden Bestimmungen im Laufe der Jahre erheblich an Bedeutung gewonnen.

Dabei darf aber keinesfalls außer Acht gelassen werden, dass der Genotyp lediglich eine genetische Konstellation, aber keine Stärke der biologischen Funktion beschreibt. In der Praxis wichtiger ist der Phänotyp, welcher auf dem biologischen Produkt des Genotyps unter Berücksichtigung anderer möglicherweise interagierender Gene bzw. Mechanismen basiert. Zudem kann über den Phänotyp eine Aussage z.B. über die Stoffwechselaktivitäten bestimmter Haplotypen (Allele) oder Haplotyp-Paare (Genotypen) gemacht werden.

Der Nachteil der Phänotypisierung besteht in der oft sehr aufwendigen Untersuchungsmethode. Daher wurde nach Möglichkeiten gesucht, mit Hilfe von High-Tech-Untersuchungsmethoden, die es ermöglichen, innerhalb von kurzer Zeit eine Vielzahl von Proben zu untersuchen, zusätzliche genetisch basierte Informationen zu gewinnen. Ein in dieser Hinsicht erfolgversprechender Ansatz ist die Untersuchung von messenger RNA (mRNA). mRNA erlaubt eine Aussage zur Stärke der Expression des zu untersuchenden Gens und kann zudem mit modernen Labormethoden zunehmend kostengünstiger untersucht werden. Da dieser methodische Ansatz sehr vielversprechend ist, wurden Expressionsprofile von mRNA im menschlichen Organismus mit Hilfe von Microarrays untersucht und der Allgemeinheit in entsprechenden Datenbanken zur Verfügung gestellt [6]. Der Nachteil dieser Methode besteht darin, dass es über viele Jahre technisch sehr schwierig war oder, bei Anwendung von bestimmten Fixierungsmethoden sogar unmöglich war, mRNA aus formalinfixierten Gewebeproben zu extrahieren und zu bestimmen [7].

Bedeutung der mRNA

Die Up- und Down-Regulierung der Genexpression ist generell bei der Exposition gegen Fremdstoffe von Interesse. Diese kann sehr gut durch die Untersuchung der entsprechenden mRNA bestimmt werden. Neben bestimmten Medikamenten ist in diesem Bereich zunächst vor allem die Exposition gegen Tabakrauch von Interesse. Zum einen ist aus toxikologischer Sicht von Bedeutung, welche fremdstoffmetabolisierenden Enzyme und andere Genprodukte bei Rauchern reguliert werden. Aus klinischer Sicht wäre es von Interesse, ob sich ein Expressionsmuster eher herauf bzw. herunter geregelter Gene erkennen lässt und ob zum Beispiel bei diesen Harnblasenkarzinompatienten eine Fortführung des Zigarettenrauchens mit einem überdurchschnittlich hohen Risiko ein Rezidiv zu erleiden assoziiert ist oder ob die Expressionsmuster für ein Ansprechen einer lokalen Therapie des Tumors in die Harnblase durch Einbringen eines Zytostatikums oder des Immuntherapeutikums BCG (Bacillus Calmette-Guérin), einem abgeschwächten Erreger der Rindertuberkulose (Mycobacterium bovis), mittels eines Harnblasenkatheters spricht.

Gewinnung der Zellen mit einer Mikrobürste

Im Rahmen der Entfernung des Tumor durch die Harnröhre (TUR, transurethrale Resektion) wurden bei 25 Patienten nach entsprechender Aufklärung und Einwilligung der Patienten Zellen von dem Tumorgewebe sowie Zellen von makroskopisch gesundem Gewebe abgebürstet. Hierfür wurde jeweils zunächst eine sterile Zytologiebürste für das makroskopisch gesunde Gewebe und danach eine andere sterile Zytologiebürste für das Tumorgewebe verwendet.

Die Größe der wiederverwendbaren Bürsten betrug 2 x 10 mm (Abb. 1), der Hub am Bürstenhandgriff betrug 50 mm (pK endoskopie Paul Kneschaurek, Hannover). Nach dem Gebrauch wurden die Bürsten gesäubert und sterilisiert gemäß den Richtlinien für medizinische Geräte.

Konservierung und Lagerung der gewonnenen Zellen

Die gebürsteten Zellen wurden sofort in RNAlater, ein RNA stabilisierendes Reagenz (Qiagen, Hilden [8]) gemäß den Vorgaben des Herstellers überführt, d. h. 10 μl Reagenz pro 1 mg Gewebe. Hiernach wurde die Probe bei -20°C gelagert.

Isolierung der mRNA, Umschreibung in cDNA und deren Vervielfältigung

Später wurde die mRNA unter Verwendung des RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden [9]) isoliert und sofort in cDNA umgeschrieben und vervielfältigt (QuantiTect Whole Transcriptome Kit, Qiagen, Hilden [10]). Die durchschnittlich pro Bürstung gewonnene RNA-Menge pro Patient betrug 99,5 ng/μL bei Tumorgewebe und 66,3 ng/μL bei makroskopisch tumorfreiem Gewebe (Abb. 2). Die cDNA wurde bei -20°C bis zur Analyse mittels PCR oder RT-PCR gelagert. Die Menge der vervielfältigten cDNA reicht für eine Vielzahl von Analysen aus.

Duplex-PCR und Real Time PCR

An der gewonnenen cDNA wurde beispielhaft die Bestimmung von Glutathion-S-Transferase M1 (GSTM1) mittels Duplex-PCR [11] (Abb. 3), die von rs9642880 [12] sowie die Expression von c-Myc mittels Real Time PCR mit einem ABI7500 unter Verwendung von TaqMan Assays (Applied Biosystems, Darmstadt) durchgeführt.

Geringe Invasivität im Vergleich zu anderen Methoden

Der Einsatz von Zytologiebürsten bei zystoskopischen Untersuchung ist für den Patienten die mit Abstand am wenigsten invasive Technik zur Gewinnung von Urothelzellen, im Vergleich zu Biopsiezangen, oberflächigen kalten Probeexzisionen oder oberflächigen bipolaren Resektionen. Die Eingriffsdauer wird durch die Gewinnung von Zellen mit der Mikrobürste nur wenig verlängert. Somit ist diese Methode weniger belastend und definitiv mit weniger unerwünschten Nebenwirkungen verbunden. Dies dürfte eine positive Bewertung der zuständigen Ethik-Kommission ebenso erleichtern wie die schriftliche Einverständniserklärung der Patienten.

Weitere Anwendungsgebiete

Ein für Zellkulturen nicht unerheblicher Vorteil dieser Methode ist, dass aufgrund der Gewinnung von Zellen aus oberflächlichen Gewebeschichten die gewonnenen Epithelzellen nicht durch Fibroblasten verunreinigt sind, die aufgrund ihres Wachstumsvorteils gegenüber Epithelzellen bei Zellkulturen problematisch sind.

Fazit

Die vorgestellte wenig invasive Methode erlaubt die Untersuchung von Genexpressionen in der Harnblase bei täglichen urologischen Routineoperationen, ohne dass für die gewonnenen Proben flüssiger Stickstoff vorgehalten werden muss [3]. Zudem könnte sie prinzipiell auch bei anderen endoskopisch zugänglichen Organen wie z. B. Lunge oder Darm angewendet werden.

Autoren
Klaus Golka1, Christoph Kuhn2, Alexander Kress2, Matthias Hermes1

Zugehörigkeit
1Leibniz-Institut für Arbeitsforschung an der TU Dortmund (IfADo), Dortmund, Deutschland
2Urologische Klinik, Klinikum Dortmund, Dortmund, Deutschland

Kontakt  
Prof. Dr. Klaus Golka

Leibniz-Institut für Arbeitsforschung
an der TU Dortmund (IfADo)
TU Dortmund
Dortmund, Deutschland
golka@ifado.de

Literatur
1 Ye X. et al.: In: Issaq H. J. and Veenstra T. D. (Eds) Proteomic and metabolomics approaches to biomarker discovery. Academic Press, London, pp. 40-51 (2013)
2 Zylka-Menhorn V., Siegmund-Schultze N.: Dtsch. Ärztbl. 207 C, 328 (2010)
3 Kuhn C. et al.: J. Toxicol Environ Health A 80, 411-416 (2017)
4 Dodd L. G. et al.: Acta Cytol. 41, 377-384 (1997)
5 González-Peramato P. et al.: Arch. Esp. Urol. 57, 227-238 (2004)
6 Petryszak R. et al.: Nucleic Acids Res. 44, D746-752 (2016)
7 Tanca A. et al.: J. Proteomics 77, 561–576 (2012)
8 Qiagen: RNAlater Handbook RNAlater RNA Stabilization Reagent. (2006) https://www.qiagen.com/de/resources/resourcedetail?id=14e7cf6e-521a-4cf7-8cbc-bf9f6fa33e24&lang=en
9 Qiagen: RNeasy® Micro Handbook (2014) https://www.qiagen.com/de/resources/resourcedetail?id=14e7cf6e-521a-4cf7-8cbc-bf9f6fa33e24&lang=en
10 Qiagen: QuantiTect-Whole-Transcriptome-Handbook. (2011) https://www.qiagen.com/de/resources/resourcedetail?id=6910f167-e4ae-43a2-b87d-26a74c55a75c
11 Kempkes M. et al.: Arch. Toxicol. 71, 123-126 (1996)
12 Kiemeney L. A. et al.: Sequence variant on 8q24 confers susceptibility to urinary bladder cancer. Nat. Genet. 40, 1307-1312 (2008)

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Ardeyst. 67
44141 Dortmund , Nordrhein-Westfalen
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