MIR-Transmissionsspektroskopie Verfahren

Überwachung und Charakterisierung von Bioprozessen

  • Abb. 1: Automatisierter MIRA AnalyzerAbb. 1: Automatisierter MIRA Analyzer
  • Abb. 1: Automatisierter MIRA Analyzer
  • MIR-Transmissionsspektroskopie Verfahren - Überwachung und Charakterisierung von Bioprozessen (© endostock - Fotolia.com)
  • Abb. 2:  Prozessanalytik von Glucose, Acetat und Phosphat mit MIR-Transmissionsspektroskopie während einer Kultivierung von E. coli TB1 pGLO. Die Kultivierung erfolgte mit exponentiellem Zufütterungsprofil in einem Multibioreaktorsystem. Zur pH-Wert-Regelung wurden 0,33 M Phosphorsäure und 25% Ammoniak verwendet. Die Referenzanalytik von Glucose, Acetat und Phosphorsäure erfolgte mit enzymatischen Testkits. OUR und CER wurden über eine Abgasanalyse erfasst. Die Kultivierung wurde betriebsbedingt für etwa 20h unterbrochen, daher beginnt die Fed-Batch-Phase erst nach etwa 22h.
  • Abb. 2:  Prozessanalytik von Glucose, Acetat und Phosphat mit MIR-Transmissionsspektroskopie während einer Kultivierung von E. coli TB1 pGLO. Die Kultivierung erfolgte mit exponentiellem Zufütterungsprofil in einem Multibioreaktorsystem. Zur pH-Wert-Regelung wurden 0,33 M Phosphorsäure und 25% Ammoniak verwendet. Die Referenzanalytik von Glucose, Acetat und Phosphorsäure erfolgte mit enzymatischen Testkits. OUR und CER wurden über eine Abgasanalyse erfasst. Die Kultivierung wurde betriebsbedingt für etwa 20h unterbrochen, daher beginnt die Fed-Batch-Phase erst nach etwa 22h.
  • Abb. 2:  Prozessanalytik von Glucose, Acetat und Phosphat mit MIR-Transmissionsspektroskopie während einer Kultivierung von E. coli TB1 pGLO. Die Kultivierung erfolgte mit exponentiellem Zufütterungsprofil in einem Multibioreaktorsystem. Zur pH-Wert-Regelung wurden 0,33 M Phosphorsäure und 25% Ammoniak verwendet. Die Referenzanalytik von Glucose, Acetat und Phosphorsäure erfolgte mit enzymatischen Testkits. OUR und CER wurden über eine Abgasanalyse erfasst. Die Kultivierung wurde betriebsbedingt für etwa 20h unterbrochen, daher beginnt die Fed-Batch-Phase erst nach etwa 22h.

Zeitnahe, präzise Erfassung vieler Prozessparameter, bei gleichzeitiger einfacher und verlässlicher Auswertung ist in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung heute von immenser Bedeutung. Daher bedarf es einer Technik die, online eingesetzt, aussagekräftige und übertragbare Messdaten liefert. In diesem Artikel wird eine neue Herangehensweise vorgestellt, die MIR-Transmissionsspektroskopie innerhalb der Bioprozesstechnik anzuwenden.

In den letzten Jahren hat die Entwicklung neuer Biopharmazeutika stetig an Bedeutung gewonnen, trotzdem fehlen der Bioprozesstechnik weitgehend noch die geeigneten Echtzeit-Messverfahren. Spektroskopische Verfahren haben tendenziell das größte Potential diese Lücke zu schließen, jedoch konnte sich bisher noch kein Verfahren etablieren. Bisher eingesetzte Verfahren wie NIR, Raman oder ATR können die gestellten Anforderungen nicht erfüllen. NIR und Raman weisen eine zu geringe analytische Bandbreite oder eine zu geringe Aktivität der gesuchten Analyten im entsprechenden Spektralbereich auf [1], [2]. Weitere Nachteile beim Einsatz von ATR sind, dass die Absorptionen wellenlängenabhängig sind und Grenzflächeneffekte zwischen optischem Material und der Probenflüssigkeit, beispielsweise in Form von Adsorption oder Denaturierung der Probe, auftreten können [1], [3], [4]. Darüber hinaus stellt die Übertragbarkeit von Spektrendatenbanken beziehungsweise chemometrischen Modellen von Gerät zu Gerät ein Problem dar [5].

Der Einsatz der Mittelinfrarot-Transmissionsspektroskopie (spektraler Bereich von 4000 cm-1 bis 400 cm-1) bei der Überwachung von Herstellungsprozessen sowie für das Wirkstoffscreening gehört, auf Grund des hohen Informationsgehaltes der Spektren, zu den Standardverfahren in der chemischen-pharmazeutischen Industrie. Bisher konnte dieses Verfahren jedoch nicht für wässrige Proben eingesetzt werden. Grund hierfür ist die starke Absorption von Wasser im mittleren Infrarotbereich und der damit verbundenen Totalabsorption. Die technologischen Anforderungen an MIR-Systeme für den Einsatz mit wässrigen Proben sind mit Schichtdicken im Mikrometerbereich und Schichtdicken-Genauigkeiten im Nanometerbereich sehr hoch.
Neue Schnittstellentechnologie

MIR-Messtechnik

Durchflussmesszellen zur Transmissionsmessung sind in der Infrarotspektroskopie bekannt und etabliert.

Bei derartigen Zellen wird die zu vermessende flüssige Probe über Zu- und Abführkanäle durch einen optischen Messraum hindurchgeleitet, welcher durch infrarottransparente Fenster begrenzt wird. Bei dem hier vorgestellten MIR-Transmissionsspektroskopie Verfahren wird eine mikrosystemtechnisch hergestellte Präzisions-Durchflusszelle eingesetzt, die definierte Schichtdicken unter 10 µm aufweist und darüber hinaus extrem druckstabil ist. Die Messzelle weist eine Schichtdickengenauigkeit von unter 1 nm auf. In Kombination mit multivariaten Analysemethoden kann hierdurch das gesamte Potenzial der Mittelinfrarot-Spektroskopie auch für wässrige Proben ausgenutzt werden. Dabei sind Analysen im unteren ppm-Bereich (Nachweisgrenze: 5 – 10 mg/L) möglich, die vor allem bei der Prozessanalytik von Bioprozessen gefragt sind. Aufgrund der geringen Messzeiten von wenigen Minuten und der geringen Probenvolumina (unter 100 µL) ist eine simultane und engmaschige Quantifizierung vieler prozessrelevanter Analyten in Form einer At-& On-line Anbindung möglich. Neben der Quantifizierung von Substanzen ermöglicht die MIR-Technologie außerdem die Bestimmung von Proteinstrukturen und Konformationszuständen.

Durch die chemometrische Auswertung können zudem unbekannte Effekte, indirekte Messgrößen und qualitätsrelevante Prozessgrößen detektiert werden. Einer der größten Vorteile der Technik ist, dass mit Hilfe datenbankgestützter Algorithmen, eine völlig kalibrationsfreie Auswertung realisiert werden kann. Dies spielt vor allem in der Entwicklung von Bioprozessen eine große Rolle, da hier viele Variationen in der Medienzusammensetzung und der Prozessführung auftreten. Klassisch kalibrierte chemometrische Modelle (z. B. PLS-R Partial Least Squares Regression) müssten für jede Änderung der Medienzusammensetzung neu kalibriert werden. Aufgrund des hohen Aufwandes für die Kalibrierung können diese Verfahren nicht in der Optimierung und Entwicklung von Bioprozessen eingesetzt werden.

Anwendung der MIR-Transmissionsspektroskopiefür die Prozessanalytik während Kultivierungen von E. coli.

Die MIR-Transmissionsspektroskopie zeigt ihr Potential während Kultivierungen von E. coli im Multibioreaktorsystem. Bei diesen Kultivierungen erfolgte die begleitende Prozessanalytik mit Ausnahme der Biomassekonzentration über die MIR-Technik (Abb. 1). Für die quantitative Analyse von Nährmedienbestandteilen wie Glukose, Ammonium, Phosphat, Sulfat, Citrat und Prolin wurde ein speziell für diesen Prozess entwickelter kalibrationsfreier Vorhersagealgorithmus verwendet. Neben den wichtigsten Nährmedienbestandteilen wurden über dieses Vorhersagemodell außerdem die Nebenprodukte Acetat, Lactat, Succinat und Pyruvat erfasst. Das bedeutsamste Nebenprodukt Acetat wird von E. coli unter aeroben Bedingungen bei Glucoseüberschuss gebildet und beeinträchtigt das Zellwachstum sowie die Produktbildung. Die zeitnahe Analytik von Acetat trägt daher maßgeblich zu einer effizienten Prozessführung bei und steht bisher nicht als Online-Messgröße zur Verfügung. Zur Überprüfung des Vorhersagealgorithmus werden die Analyseergebnisse aus der MIR-Transmissionsspektroskopie mit klassischer Referenzanalytik verglichen (Abb. 2).

Ausblick

Kurze Messzeiten, das Umgehen aufwendiger Probenvorbereitung, komplette Digitalisierung der Ergebnisse und der hohe Informationsgehalt eröffnen der MIR-Technologie ein weites Spektrum an innovativen Einsatzmöglichkeiten und bieten gleichzeitig bedeutsame Zeit- und Kostenvorteile. Wie der Einsatz der MIR-Transmissionsspektroskopie bei der Kultivierung zeigt, kann das Verfahren bei der Bioprozessentwicklung sein ganzes Potential entfalten. Durch die schnelle und umfassende Analytik sowie durch die Möglichkeit der Anbindung multipler Entwicklungsreaktoren an ein automatisiertes Messsystem, können effiziente Screenings durchgeführt werden. Die ganzheitliche Erfassung der Parameter ist eine wesentliche Voraussetzung für moderne Quality-by-Design Ansätze, die ein tieferes Verständnis des gesamten Prozesses erfordern. Im Gegensatz zu den gängigen Verfahren wie HPLC oder MS, verlangt die MIR-Transmissionsspektroskopie vom Endbenutzer keine komplexe Auswertung. Eine kontinuierliche Erweiterung der Substanzendatenbank für den Vorhersagealgorithmus ermöglicht in Zukunft zudem die Erfassung vieler weiterer Stoffe, ohne dass dabei weitere analytische Verfahren etabliert werden müssen.

Literatur
[1]    Payal Roychoudhury et al.: Analytica Chimica Acta, 571(2), 159-166, (2006)
[2]    Mazarevica G. et al.: Appl. Spectrosc., 58(7),  804–10, (2004)
[3]    Känsäkoski M. et al.: VTT Tech. Res. Cent. Finl., 60, 99, (2006)
[4]    Kondepati V. R. únd Heise H. M.: Trends Biotechnol., 2(1), 117–132, (2008)
[5]    Günzler H. and Gremlich H.-U.: IR-Spektroskopie: Eine Einführung, 4th ed. Weinheim: WILEY-VCH, 2003.

Gefördert durch: Bundesministerium für Wirtschaft und Energie aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages

Autoren
H. Horakh1, R.Masuch1, J. Hoffmann1, A. Wolf1, A. Steinkämper2, R. Biener2

Zugehörigkeit
1micro-biolytics GmbH, Essling
2Fakultät Angewandte Naturwissenschaften, Hochschule Esslingen

Kontakt
Prof. Dr.-Ing. Richard Biener

Fakultät Angewandte Naturwissenschaften
Hochschule Esslingen

Kontaktieren

Hochschule Esslingen
Kanalstr. 33
73728 Esslingen
Deutschland
Telefon: +49 711 397-49
Telefax: +49 711 397 31 00

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.