Mit grünen gegen rote Viren

Einsatz von Pflanzenviren für die Impfstoffproduktion

  • Abb. 1: Nicotiana benthamiana Pflanze mit rekombinantem GFP-PVX Vektor infiziert.  A) unter Normallicht, die ganze Pflanze erscheint grün B) unter UV-Licht, die Pflanze erscheint durch die Autofluoreszenz des Chlorophylls rot. Die grünen Bereiche enthalten das vom Virusexpressionsvektor produzierte GFP  Abb. 1: Nicotiana benthamiana Pflanze mit rekombinantem GFP-PVX Vektor infiziert. A) unter Normallicht, die ganze Pflanze erscheint grün B) unter UV-Licht, die Pflanze erscheint durch die Autofluoreszenz des Chlorophylls rot. Die grünen Bereiche enthalten das vom Virusexpressionsvektor produzierte GFP
  • Abb. 1: Nicotiana benthamiana Pflanze mit rekombinantem GFP-PVX Vektor infiziert.  A) unter Normallicht, die ganze Pflanze erscheint grün B) unter UV-Licht, die Pflanze erscheint durch die Autofluoreszenz des Chlorophylls rot. Die grünen Bereiche enthalten das vom Virusexpressionsvektor produzierte GFP
  • Abb. 2: Schematische Darstellung eines PVX Partikels
  • Abb. 3: Elektronenmikroskopische Aufnahme von Immunogold markierten chimären PVX Partikeln. Das Fremdepitop wurde mit einem epitopspezifischen, primärem Mausantikörper und einem mit 15 nm Gold-markiertem Sekundärantikörper nachgewiesen.
  • Tab. 1: Repräsentative Antigene die mit Hilfe rekombinanter Pflanzenviren produziert wurden
  • Dr. Kerstin Uhde-Holzem, RWTH Aachen
  • Dr. Ulrich Commandeur, RWTH Aachen

Das Interesse an der Entwicklung von „grünen" Pflanzenviren als Expressionsvektoren für die Herstellung von Impfstoffen gegen humane „rote" Viren ist in den letzten Jahren immer mehr gewachsen.

Pflanzen beginnen sich in dem umkämpften Bereich der biotechnologischen Produktionssysteme für rekombinante Proteine immer stärker zu etablieren. Dies ist darauf zurückzuführen, dass Pflanzen zahlreiche Vorteile gegenüber den herkömmlichen auf der Fermentation basierenden Technologien bieten: die geringen Kosten für die großtechnische Produktion, die unbegrenzte Maßstabsvergrößerung, die Fähigkeit pflanzlicher Zellen, eukaryotische post-translationale Modifikationen durchzuführen und das Fehlen human pathogen Krankheitserreger [1]. Nach einer Reihe von erfolgreichen Machbarkeitsstudien und ersten klinischen Studien erregen Pflanzen großes kommerzielles Interesse, und auch hochkarätige internationale Forschungsprogramme sind mittlerweile für die Entwicklung von Pharmazeutika aus Pflanzen angelaufen [2]. Rekombinante Antikörper und Impfstoff-Kandidaten stehen im Vordergrund dieser Forschungs- und Entwicklungs-Programme, die durch die jüngst erteilte Genehmigung für den ersten aus Pflanzen gewonnenen Geflügelimpfstoff, der von der amerikanischen Firma Dow AgroSciences vermarktet wird, noch gefördert werden.

Rekombinante Pflanzenviren

Eine Vielzahl von Pflanzen-basierten Expressionssystemen stehen mittlerweile für die Impfstoffproduktion zur Verfügung. Dabei spielt die Verwendung von rekombinanten Pflanzenviren zur Produktion von heterologen Proteinen in planta eine immer größere Rolle. Virale Genome sind viel einfacher zu verändern als Pflanzengenome, und die Infektion von Pflanzen mit rekombinanten Viren geht sehr viel schneller als die Herstellung transgener Pflanzen. Potenziell können Pflanzen, die rekombinante Viren enthalten, im gleichen Umfang wie transgene Pflanzen angezogen werden, besitzen aber eine viel kürzere Entwicklungszeit. Obwohl das Transgen nur im viralen Genom und nicht im Pflanzengenom integriert vorliegt, wird das exprimierte Protein in der gleichen Weise prozessiert wie ein endogenes Pflanzenprotein, so dass korrekte Faltung, Targeting und post-translationale Modifikation des Proteins möglich sind.

Das virale Expressionssystem ist daher besonders einfach, flexibel und effizient, und verfügt über das Potenzial für die schnelle und bequeme Herstellung von rekombinanten Proteinen in hoher Ausbeute, sowohl in geschlossenen als auch offenen Systemen.

Strategien zur Konstruktion von Pflanzenviren

Die meisten Pflanzenviren haben +-Strang-RNA-Genome, und es sind eben diese Viren, die am häufigsten als Expressionsvektoren genutzt werden. In frühen Experimenten wurden zunächst DNA-Viren für Vektorkonstruktionen herangezogen, weil zu diesem Zeitpunkt cDNA Kopien der RNA-Genome noch nicht erzeugt werden konnten und die geringere Replikationsgenauigkeit der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase zunächst Bedenken hervorrief. DNA-Viren haben jedoch wie offensichtlich alle isometrischen Viren eine eingeschränkte Kapazität für die Aufnahme von Fremd-Nukleinsäuren. Der einzige Weg diese Größenlimitierung zu umgehen, ist für die Virusvermehrung nicht essentielle Gene zu entfernen. Allerdings hat dies unter Umständen einen negativen Einfluss auf die Virus-Akkumulation. Bei stäbchenförmigen Viren gibt es weniger Einschränkungen in Bezug auf die Größe des Transgens, das unter Erhalt aller wichtigen Virus-Funktionen zum vollständigen viralen Genom hinzugefügt werden kann. Andere Gründe für die spätere Fokussierung auf RNA-Viren beinhalten die breite Palette an Wirtspflanzen, hohe Virustiter und die Tatsache, dass die meisten viralen RNA-Genome, die in die pflanzlichen Zellen eingeführt wurden, direkt übersetzt werden und somit unmittelbar sehr ertragreich Protein liefern können.

Bei der Verwendung von RNA Viren wird die Kopie des rekombinanten viralen Genoms entweder in vitro transkribiert, um infektiöse RNA zu erhalten, die im folgenden zur Inokulation von Pflanzen verwendet wird, oder sie wird als Expressionseinheit unter die Kontrolle eines pflanzlichen Promoters gestellt, um die virale, genomische RNA in vivo zu erzeugen.

Virale Expressionssysteme

Zwei Hauptstrategien werden zur Zeit für die Produktion von Impfstoff-Kandidaten unter Verwendung von Pflanzenviren verfolgt: i) das Ziel-Antigen wird als eigener offener Leserahmen (ORF) in das virale Genom integriert, wobei die Expression von einem subgenomischen RNA Promoter gesteuert wird, und ii) die Ziel-Antigene werden als Leserasterfusionen mit dem viralen Hüllprotein exprimiert, so dass die fremden antigenen Bereiche (Epitope) auf der Oberfläche des chimären Partikels präsentiert werden. Bei der ersten Strategie ist das heterolog exprimierte Protein das eigentliche Produkt. Die Viruspartikel und alle endogenen Pflanzenproteine werden nach der Aufreinigung des rekombinanten Produkts verworfen. Dieses Vorgehen ist analog zur Produktion von
rekombinanten Proteinen in konventionellen transgenen Pflanzen. Dagegen ist bei dem Epitop-Präsentationssystem der komplette Viruspartikel das gewünschte Produkt, und nur die Virus-Partikel werden aus der Pflanze präpariert. Hier fungiert das Virus nicht nur als Expressionsvektor sondern auch als Matrix, um die Epitope dem Immunsystem zu präsentieren. Solche rekombinanten Partikel sind leicht aufzureinigen und können Erreger-spezifische Immunantworten verstärken, weil sie vielfache Kopien der Epitope auf ihrer Oberfläche präsentieren [3].

Eine ganze Reihe verschiedener Pflanzenviren sind bereits als Expressions- und/oder Präsentationsvektoren entwickelt worden. Die am häufigsten verwendeten sind: Tabakmosaikvirus (TMV), Kartoffelvirus-X (PVX), Kuhbohnen-Mosaic-Virus (CPMV), Pflaumen-Pocken-Virus (PPV) und Alfalfa-Mosaik-Virus (ALMV). Einige ausgewählte Beispiele von Impfstoff-Kandidaten, die mit Hilfe von Pfanzenviren produziert wurden, sind in Tabelle 1 zusammen gefasst.

Das Kartoffelvirus X (PVX)

Das Kartoffelvirus X (Potato virus X, PVX) ist der Stellvertreter der Potexviren und befällt viele Arten der Familie Solanaceen. In den systemisch infizierten Pflanzen ruft es charakteristische Symptome wie chlorotisches Mosaik und gelbliche Flecken hervor (Abb. 1A). PVX wird von keinem natürlichen Vektor übertragen, sondern durch direkten Kontakt zwischen den Pflanzen. Infolgedessen kann das Virus durch mechanische Inokulation in Wirtspflanzen einfach vermehrt werden.

PVX ist ein monopartites (+)-Strang RNA-Virus mit einer genomischen RNA von 6,4 kb Länge. Das PVX-Genom enthält fünf ORFs, von denen das 3‘-terminale ORF für das 236 AS lange Hüll-protein kodiert, von dem sich 1270 Untereinheiten zu einem flexiblen stäbchenförmigen Partikel zusammenlagern (s. Abb. 2+3). Obwohl es keine detaillierten Informationen über die Faltung und die Art der Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten gibt, wird angenommen, dass der N-terminale Teil des Hüllproteins auf der Oberfläche der Virionen exponiert vorliegt [4]. Cruz et al. [5] haben sich diese Information zu Nutze gemacht und N-terminale Proteinfusionen hergestellt. Experimentelle Untersuchungen ergaben, dass Proteine unterschiedlicher Größe durch Fusion mit dem Hüllprotein auf der Oberfläche von PVX exprimiert und funktionelle PVX-Partikel gebildet werden. Bei großen Proteinen wie z.B. dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) allerdings nur, wenn neben dem rekombinanten-Hüllprotein auch Wildtyp-Hüllprotein vorliegt (Abb. 2). Dies ist das sogenannte „overcoat" Prinzip, das z.B. durch die Insertion einer speziellen Peptid Sequenz zwischen Fremdprotein und Hüllprotein erreicht wird (Abb. 2). Die Präsentation kurzer Peptide gelingt jedoch häufig auch, wenn diese direkt mit dem Hüllprotein fusioniert werden, wie von uns für zwei Epitope des Beet Rhizomania-Virus einzeln (Abb. 3) und in Kombination nachgewiesen werden konnte [6]. Allerdings konnten wir ein 27 Aminosäuren langes Hepatitis-C-Virus R9 Mimotop, das einen für die Präsentation unvorteilhaft hohen isoelektrischen Punkt (IP) besitzt [7], nur in Kombination mit der o.g. 2A Sequenz oder in Kombination mit einem „neutralisierenden" Epitop des Humanen Papilloma Virus mit niedrigem IP auf PVX Partikeln präsentieren. Die chimären HCV Partikel des R9-2A Konstrukts riefen in Mäusen sehr hohe Immunglobulin G (IgG) Titer von bis zu 1:100000 hervor (Uhde-Holzem, et al., unveröffentlicht). Daneben lieferten insbesondere auch rekombinante PVX Partikel, die das hoch konservierte humane Immunodefiziens-Virus (HIV) Epitop ELDKWA des Glykoproteins (gp) 41 in Form einer N-terminalen translationalen Fusion mit dem Hüllprotein präsentierten, vielversprechende Ergebnisse [8]. Die aufgereinigten Virus-Partikel wurden zur intraperitonealen oder intranasalen Immunisierung von Mäusen eingesetzt und riefen hohe Titer an HIV-1-spezifischen IgG und IgA-Antikörpern hervor.

Damit sind auf PVX-basierte rekombinante Viruspartikel als Träger von Fremdepitopen vielversprechende Biomaterialien für die zukünftige Herstellung von potenziellen Impfstoffkandidaten.

Referenzen
[1] Twyman R. M. et al.: Expert Opin Emerg Drugs 10 (1), 185-218 (2005)
[2] Ma J. K. et al.: Trends Plant Sci 10 (12), 580-585 (2005)
[3] Porta C. et al.: Rev Med Virol 8 (1), 25-41 (1998)
[4] Parker L. et al.: Virology, 300 (2), 291-295 (2002)
[5] Cruz S. S. et al.: Proc Natl Acad Sci U S A 93 (13), 6286-6290 (1996)
[6] Uhde K. et al.: Arch Virol 150 (2), 327-340 (2005)
[7] Uhde-Holzem K. et al.: Arch Virol 152 (4), 805-811 (2007)
[8] Marusic C. et al.: J Virol 75 (18), 8434-8439 (2001)

Autor(en)

Kontaktieren

RWTH Aachen University
Worringerweg 1
52074 Aachen
Germany
Telefon: +49 241 8028131
Telefax: +49 241 871062

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.