Mit Röntgenstrahlen in den Mikrokosmos

Synchrotron-Röntgen-Mikrotomographie für nicht-invasive Visualisierung mikroskopischer Strukturen

  • Abb. 1. Vergleich von Phasenkontrast-Tomographie (a) und Holotomographie (b) eines virtuellen Querschnittes durch die Hornmilbe Archegozetes longisetosus mit den korrespondierenden 3D-Rekonstruktionen (c, d).
  • Abb. 2. Rekonstruktionen der fossilen Hornmilbe Neoliodes dominicus. (a) Probenhalter mit angebrachtem Bernstein (Pfeil zeigt auf die eingeschlossene Hornmilbe), (b-d) Virtuelle Horizontalschnitte durch die 3D-Rekonstruktion (Pfeil in c zeigt auf ein erhaltenes Ei).
  • Abb. 3. 3D-Rekonstruktion eines virtuellen Sagittalschnittes durch ein Laufbein von Archegozetes longisetosus mit der für die Bewegung des Beines und der Kralle verantwortlichen Muskulatur.
  • Abb. 4. Segmentierung der an der Ptychoidie beteiligten Muskulatur bei zwei Arten der Euphthiracaroidea. Links ist die linke Körperhälfte von Oribotritia banksi zu sehen, rechts im Vergleich dazu die rechte Körperhälfte von Rhysotritia ardua.
  • Das Hornmilben-Team. Von links: Dr. Michael Heethoff (Gruppenleiter); Dipl.-Biol. Michael Laumann (Doktorand: Embryogenese); Dipl.-Biol. Sebastian Schmelzle (Doktorand: Ptychoidie); Uwe Kurz (Diplomand: Funktionsmorphologie); Dipl.-Biol. Paavo Bergmann (Doktorand: Entwicklungsbiologie)., Institut für Evolution und Ökologie, Abteilung für Evolutionsbiologie der Invertebraten, Universität Tübingen.

Computertomographie ist eine wichtige Methode in der diagnostischen Medizin und den morphologisch orientierten Biowissenschaften. Konventionelle Computertomographen haben jedoch eine recht geringe Auflösung (bis 300 µm) und eignen sich nur bedingt zur Visualisierung von Weichgeweben. Synchrotron-generierte Röntgenstrahlen hingegen führen zu einer etwa 1000-fach höheren Auflösung und eignen sich auch für Materialien mit geringer Röntgendichte. So können auch mikroskopisch kleine Organismen zerstörungsfrei untersucht werden.

Der Blick ins Innere


Es ist seit jeher Anliegen der Naturforscher die Funktion und Evolution von Organismen zu verstehen. Das Verständnis solcher komplexen Systeme erschließt sich jedoch erst dann, wenn der innere Aufbau und der Zusammenhang beteiligter Strukturen bekannt sind. Der Organismus wird hierzu traditionell seziert und/oder durch histologische Techniken mikroskopisch untersucht. Dabei wird er zerstört und der natürliche Zusammenhang des inneren Aufbaus geht häufig verloren.

Ende des 19. Jahrhunderts entdeckte W. C. Röntgen die nach ihm benannte Strahlung. Dies revolutionierte die medizinische Diagnostik, da Röntgenstrahlen Weichgewebe wie innere Organe und Muskeln fast ungehindert durchdringen können, jedoch von Knochenstrukturen stärker absorbiert werden. Eine Röntgenaufnahme liefert dabei immer eine zwei-dimensionale Integration der Röntgendichte des durchstrahlten Materials. Die Welt ist jedoch nicht flach! In den 1970er Jahren entwickelten A. M. Cormack und G. Hounsfield die Computertomographie (CT, Nobelpreis 1979), wodurch die zerstörungsfreie drei-dimensionale Darstellung des inneren Aufbaus von Objekten möglich wurde. Heute gehört die Computertomographie zu den Standardverfahren der medizinischen Diagnostik und der morphologisch orientierten Biowissenschaften. Klinische Computertomographen sind beschränkt auf größere Objekte mit hoher Röntgendichte - sie liefern im Bereich der Absorption eine räumliche Auflösung von etwa 300µm, vergleichbar mit dem menschlichen Auge. Viele biologische Materialien (wie Muskel- und Nervengewebe) besitzen jedoch kaum Röntgenabsorption und sind zudem häufig kleiner als die Auflösungsgrenze dieser Apparate.

Für tomographische Untersuchungen solcher Objekte können die von einigen Synchrotronen erzeugten Röntgenstrahlen verwendet werden. Anders als die mit einer Röntgenröhre erzeugte konische Strahlung ist die Synchrotronstrahlung hoch parallel und erlaubt die Anwendung von Phasenkontrastmessungen für Materialien mit geringer Röntgendichte [1, 2]. Die räumliche Auflösung der Synchrotron-Röntgen-Mikrotomographie (SR-µCT) liegt bei etwa 300 nm, also im Bereich der Lichtmikroskopie. Für die Phasenkontrast-Tomographie wird eine gewisse Distanz zwischen Probe und Detektor gebracht. Wiederholt man solche Messungen mit einer Probe bei verschiedenen Distanzen, so kann man die gewonnenen Daten zu Holotomographien verrechnen. Holotomographische Daten gleichen in ihrer Erscheinung histologischen Einfachfärbungen in der Lichtmikroskopie [3; Abb. 1].

Mit Milben zum Teilchenbeschleuniger…

Unsere Forschungsgruppe beschäftigt sich mit entwicklungs- und evolutionsbiologischen Untersuchungen von Hornmilben (Oribatida). Hornmilben sind Spinnentiere und fossile Funde deuten auf ein erdgeschichtliches Alter von 380 – 420 Millionen Jahren hin. Damit gehören sie zu den ersten Landgängern und folgten unmittelbar den Landpflanzen. Mit 10.000 beschriebenen Arten und Dichten von bis zu 500.000 Individuen/m² in Waldböden stellen sie eine ökologisch wichtige Gruppe dar. Obligate Parthenogenese (Jungfernzeugung) kommt bei etwa 10% der Hornmilbenarten vor. Viele dieser Linien sind sehr erfolgreich: sie existieren zum Teil seit über 100 Millionen Jahren [4]. Andere Linien haben komplizierte Mechanismen zum Fraßschutz entwickelt und können ihre Beine und weichhäutigen Gelenke vollständig in den Körper einziehen und sich vollständig einkapseln (Ptychoidie) [5]. Trotz der ökologischen Bedeutung und evolutionsbiologisch interessanten Anpassungen weiß man wenig über die innere Organisation und funktionelle Vorgänge bei diesen Tieren. Der experimentelle Zugang zum Innenleben von Hornmilben gestaltet sich nämlich schwierig, die Tiere sind in der Regel sehr klein (< 1mm) und haben eine stark gehärtete Cuticula. Diese ist bei ausgewachsenen Tieren wenig durchlässig für Fixative und Farbstoffe und die Eihülle verschließt den Embryo gar hermetisch gegenüber sämtlichen wässrigen Lösungen. Die Anwendung standardisierter histologischer Techniken an kompletten Tieren oder Eiern ist somit schwer möglich. Die folgenden Beispiele sollen einen Einblick in die Möglichkeiten von SR-µCT für die Untersuchung der Biologie von Hornmilben geben. Die Daten wurden an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble unter der Mitarbeit von Dr. P. Cloetens und Dr. L. Helfen erhoben.

Das Bernsteinfossil

Tausende von in Bernstein eingeschlossenen Kleinstfossilien lagern in naturkundlichen Museen. Viele dieser Proben sind gut erhalten, aber kaum untersucht. Mit dem Mikroskop können zumindest die außen liegenden Strukturen gut beschrieben und verglichen werden, Informationen über innere Strukturen des eingeschlossenen Organismus lassen sich jedoch nur gewinnen, indem man den Bernstein zerstört. Die Anwendung von SR-µCT erlaubte uns 3D-Rekonstruktionen der konservierten äußeren und inneren Strukturen einer etwa 15-45 Millionen alten in Bernstein eingeschlossenen und bislang unbeschriebenen Hornmilbe - ohne den Bernstein dabei zu beschädigen [6; Abb. 2].

Hau ruck

Hornmilben besitzen acht Beine mit Krallen an den Endgliedern. Mit Mikro-Kraftmessern haben wir die Haltekräfte dieser Krallen bei der Art Archegozetes longisetosus gemessen und konnten zeigen, dass die Tiere mit einer Kraft von etwa dem 1200-fachen ihres Gewichts der Ablösung von rauhen Substraten widerstehen können. Die für diese Kraftentwicklung verantwortliche Muskulatur zur Bewegung der nur etwa 50 µm großen Krallen konnten wir durch die Verwendung von SR-µCT räumlich rekonstruieren und vermessen und so die Biomechanik des Systems verstehen [7; Abb. 3].

Deckel zu

Ptychoidie (s.o.) gehört zu den komplexesten morphologischen Anpassung zum Fraßschutz im Tierreich und wird durch ein kompliziertes Zusammenspiel einer Vielzahl von Muskelgruppen ermöglicht. Die räumliche Lage der Muskeln zueinander spielt eine wichtige Rolle - daher ist eine nicht-invasive Untersuchung mittels SR-µCT zur biomechanischen Modellierung fast unumgänglich. Wir erhoffen uns aus den Funktionsmodellen Einblicke in die Evolution und Funktion dieses Systems [5; Abb. 4].

Referenzen
[1]    Betz O et al.: Journal of Microscopy 22, 51–71 (2007)
[2]    http://www.jove.com/index/details.stp?ID=737
[3]    Heethoff M. und Cloetens P.: Soil Organisms 80, 233–247 (2008)
[4]    Heethoff M. et al.: Journal of Evolutionary Biology 20, 392–402 (2007)
[5]    Schmelzle S. et al.: Soil Organisms 80, 233–247 (2008)
[6]    Heethoff M. et al.: Journal of Paleontology 93, 153–159 (2009)
[7]    Heethoff M. und Koerner L.: Journal of Experimental Biology 210, 3036–3042 (2007)

Autoren:
Dr. Michael Heethoff, Dipl.-Biol. Michael Laumann, Dipl.-Biol. Sebastian Schmelzle, Uwe Kurz, Dipl.-Biol. Paavo Bergmann
Institut für Evolution und Ökologie, Abteilung für Evolutionsbiologie der Invertebraten, Universität Tübingen

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