Mit Rylen-Fluoreszenzsonden den Biomolekülen auf der Spur

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  • Abb. 1: Perylendiimid-Farbstoffe und ihre entsprechenden wasserlöslichen Derivate 1 sowie der
  • Abb. 2: Konfokale Fluoreszenzmikroskopie lebender HeLa Zellen, welche mit a) WS-TDI - 3, b) WS-TDI dodecyl - 4, and c) WS-TDI pyridoxy – 5 angefärbt wurden.
  • Abb. 3: a) PDI-Farbstoff (P1), der zwei verschiedene Hüllen trägt: Eine unpolare Polyphenylen-Hülle sowie eine polare Hüllen mit einer großen Zahl Carbonsäuregruppen. b) und c) Kontrastreiche Färbung von Zellkernen durch Wechselwirkung mit positiv geladenen Histon-Proteinen des Zellkerns, d) Färbung der extrazellulären Matrix durch analoge Kern-Schale PDI-Farbstoffe, die multiple positive Ladungen in ihrer äußeren Hülle tragen.

Eines der großen Ziele in der Zellbiologie adressiert die in situ Beobachtung von Biomolekülen wie Proteinen und DNA in ihrer natürlichen Umgebung. Hierfür werden vielfach Fluoreszenzfarbstoffe als Reportermoleküle eingesetzt. Die Verknüpfung einer Licht aussendenden Sonde mit einem Protein ermöglicht einzigartige Betrachtungen, beispielsweise zu welchem Zeitpunkt sich ein Protein an einem bestimmten Ort in der Zelle befindet, und mit welchen Molekülen es in Wechselwirkung tritt.

Fluoreszenzfarbstoffe stellen nahezu ideale Sonden dar, da zahlreiche ihrer Eigenschaften, wie ihre Fluoreszenzlebenszeit, Emissionsintensität, ihr Anregungs- oder Emissionsspektrum, Aufschluss über ihre nächste Umgebung vermitteln können [1]. Darüber hinaus lassen sich aus den Emissionsspektren von Farbstoffen unter Verwendung der Fluoreszenz-Mikroskopie wichtige Informationen über den genauen Ort der Sonde mit einer hohen Präzision bestimmen.

Testsysteme und Bildgebungsverfahren, die auf Fluoreszenz basieren, erlauben sehr sensitive, nicht-invasive Messungen von zellulären Vorgängen und können somit einzigartige Einsichten in die Organisation, Entwicklung und Pathologie von Zellen liefern. Insbesondere organische Farbstoffe, welche die Funktion von Biomolekülen aufgrund ihrer geringen molekularen Größe selbst nur minimal beeinflussen, haben in den vergangenen Jahren vielfältige biologische Studien in vitro und in vivo ermöglicht [2].

In jüngster Vergangenheit erlangte insbesondere die höchstauflösende Mikroskopie eine große Sichtbarkeit, der man ein großes Potential für die Aufklärung komplexer biologischer Vorgänge prognostiziert. Trotz der schnellen Entwicklung der Geräte und Informationsverarbeitung stößt man in vielen Fällen an die Leistungsgrenzen der gegenwärtig verfügbaren und kommerziell erhältlichen Farbstoffe. Leistungsstärkere und stabilere Fluoreszenzsonden werden dringend benötigt, um eine größere Detailtiefe abzubilden und der Mikroskopie zu neuen Auflösungsrekorden zu verhelfen.

Fluoreszenz-Farbstoffe
Farbstoffe, wie die Fluoresceine, 4,4'-Difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indazene (sogenannte Bodipy Farbstoffe), Rhodamine und die meisten Cyanin-Farbstoffe werden vielfältig für biologische Anwendungen herangezogen, was insbesondere auf ihren schmalen Absorptions- und Emissionsbanden, ihren hohen molaren Absorptionskoeffizienten sowie ihren moderaten bis hohen Fluoreszenzquantenausbeuten beruht.


Allerdings weisen diese Farbstoffe, mit nur sehr wenigen Ausnahmen, wie z. B. den Acridon-Farbstoffen, nur kurze Fluoreszenz-Lebenszeiten und geringe Photostabilitäten auf. Rylen-Farbstoffe konnten sich als eine weitere wichtige Farbstoffklasse etablieren, da diese nicht nur brillante Farbmittel darstellen, sondern aufgrund ihrer chemischen, thermischen, photochemischen und photophysikalischen Stabilität in Kombination mit hohen Extinktionskoeffizienten inzwischen zu den funktionalen Hochleistungsfarbstoffen avanciert sind. In diesem Übersichtsartikel werden wir jüngste Fortschritte auf dem schnell wachsenden Gebiet der wasserlöslichen Rylen-Farbstoffe diskutieren und deren einzigartige Anwendungsmöglichkeiten insbesondere für biologische Fragestellungen aufzeigen.

Perylendiimid-Farbstoffe
Die Perylendiimid-Farbstoffe (PDI) sind bereits seit der erfolgreichen Synthese von Kardos um 1910 vor mehr als einhundert Jahren bekannt (Abb. 1) [3]. Einige Dekaden später wurden Derivate von Rylen-Farbstoffen als kommerziell erhältliche Produkte hergestellt, so dass ihr Anwendungsspektrum als Hochleistungsfärbemittel und synthetische Farbstoffe bereits früh erkannt und verwertet wurde [4]. Aufgrund ihrer ausgedehnten aromatischen und lipophilen Gerüststruktur sowie ihrer starken Neigung zur Ausbildung von Aggregaten in wässriger Lösung wurden diese lange Zeit fast ausschließlich für Anwendungen in organischen Medien oder in der Festphase verwendet. Erst in den letzten zwei Jahrzehnten änderte sich diese Situation und es konnten erstmals wasserlösliche und trotz allem hoch fluoreszente Perylen- und Terrylen-Derivate beschrieben werden (Abb. 1). Dieser Erfolg wurde erst durch die Einführung neuer, hydrophiler Strukturelemente in die "bay"-Region der Farbstoffe möglich. Perylen-Derivate mit vier Sulfonsäuregruppen wiesen bereits eine herausragende Wasserlöslichkeit in Kombination mit hohen Extinktionskoeffizienten und Quantenausbeuten in Wasser auf [5].

Terrylendiimid-Farbstoffe
Die in der homologen Reihe nächst „höheren" Terrylendiimid-Farbstoffe (TDI) eignen sich ideal für Untersuchungen der Dynamik von Biomolekülen auf Einzelmolekülen, da diese brillante, „ins Rote" (bathochrom) verschobene Emissionsmaxima und eine sehr hohe chemische Stabilität besitzen [6]; auch ihre Photostabilität ist deutlich höher als die der meisten erhältlichen Farbstoffe. Erst kürzlich konnten wasserlösliche Terrylen-Derivate mit Substituenten in der bay-Region oder in der Imidstruktur beschrieben werden, deren Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln deutlich erhöht war [7]. Im Gegensatz zu den PDI-Analoga zeigten TDI-Farbstoffe mit vier Sulfonsäuregruppen (siehe Abb. 2, 3) in der bay-Region eine hohe Neigung zur Ausbildung nicht-fluoreszierender Aggregate in Wasser. Diese Kombination aus hoher Affinität für eine hydrophobe Umgebung und attraktiver Photostabilität erlaubte beispielsweise die Markierung von Lipid- und kompartmentalisierten Membranen wie künstlichen Liposomen oder Endosomen in lebenden HeLa Zellen [6]. Wasserlösliche TDI-Farbstoffe, die Dodecyl-Gruppen tragen, weisen ähnliche Eigenschaften wie 3 auf. Allerdings gelang es, die nicht-emittierenden Aggregate von 4 in lösliche, fluoreszente Monomere durch Zugabe von Lipid-Membranen zu vereinzeln. Aufgrund ihrer hohen Lipophilie zeigen diese eine enorme Affinität für die Lipid-Membranen von lebenden Zellen auf, was für Studien an Membransystemen wie beispielsweise von Transportvorgängen von großem Interesse ist. Positiv geladene Analoga des wasserlöslichen TDIs, wie die TDI-Pyridoxy-Derivate 5, zählen zu den ersten Molekülen, die in Wasser keine Aggregate ausbilden und somit attraktive Fluoreszenzeigenschaften besitzen. So konnte 5 bereits erfolgreich für die Markierung der Hülle des Herpes Simplex Virus verwendet werden [7a]. Eine Studie an einzelnen Molekülen belegte weiterhin, dass wasserlösliche TDI-Derivate eine hervorragende Photostabilität besitzen [7a].
Ein Hauptanliegen bei Rylen-Farbstoffen war es lange, die optischen Eigenschaften in wässriger Umgebung zu verbessern. Die ersten biologischen Studien basierten somit größtenteils auf nicht-kovalenten Wechselwirkungen zwischen den Farbstoffmolekülen und den zellulären Strukturen, wie z. B. den Lipid-Doppelschichten der Membranen. Eine ideale Fluoreszenzsonde sollte jedoch neben Wasserlöslichkeit und herausragenden (photo)physikalischen Eigenschaften auch „chemisch" attraktiv sein. Rylen-Farbstoffe besitzen auch hier einige Besonderheiten, die sie von anderen Farbstoffklassen abgrenzen. So können chemisch unterschiedliche funktionelle Gruppen unabhängig voneinander und räumlich gerichtet, sowohl in die Imid-Struktur als auch in die bay-Region, eingeführt werden. Auf diesem Weg lassen z.B. zwei unterschiedliche Arten von Substituenten, wie beispielsweise eine einzelne reaktive Gruppe für die Markierung des Biomoleküls und weitere, Wasserlöslichkeit vermittelnde Gruppen an das Farbstoffgerüst binden [8]. Der wasserlösliche PDI-Farbstoff 1 mit vier Sulfonsäuregruppen in der bay-Region sowie einem einzelnen reaktiven N-hydroxysuccinimid (NHS) Ester für die Biokonjugation (Abb.  3) erlaubt die Markierung von Proteinen, die zugängliche Lysinreste auf ihrer Oberfläche besitzen. So konnte das Enzyms Phospholipase durch die erfolgreiche Umsetzung eines zugänglichen Lysinrestes mit dem PDI-Farbstoff 2 markiert werden. Die Bewegung konnte erstaunlicherweise sogar auf fluoreszenz-markierten Substrat-Oberflächen sowie auf einem natürlichen Substrat wie der Phospholipid-Schicht beobachtet werden [9].

Die Markierung eines Proteins an bestimmten Positionen auf seiner Oberfläche mit einem einzelnen Fluoreszenz-Donor- und einem entsprechenden Akzeptor-Farbstoff ermöglicht weiterhin Studien der Konformation, Dynamik sowie der Faltung einer Protein-Population sowie eines einzelnen Proteins in Lösung unter Verwendung des Fluoreszenz Resonanz Energietransfers (FRET). Zu diesem Zweck muss der Farbstoff kontrolliert und mit hoher räumlicher Präzision in das Proteingerüst eingeführt werden. Die oben beschriebene Markierung von Lysinresten verläuft nur dann ortsgerichtet und unter Bildung eines homogenen Produkts, wenn sich ein einziger, zugänglicher Lysinrest auf der Proteinoberfläche befindet. Somit stellt die definierte chemische Modifikation von Proteinen ein kompliziertes Unterfangen dar, da Proteine in der Regel zahlreiche reaktive Aminosäuregruppen auf ihrer Oberfläche besitzen. Fluoreszenzfarbstoffe lassen sich neben der bereits beschriebenen Reaktion mit Lysinresten insbesondere an freie (nicht oxidierte) Cysteinreste anfügen [10], da diese in Proteinen nur selten vorhanden sind und molekularbiologisch in die Aminosäuresequenz nachträglich eingefügt werden können. Weiterhin lassen sich durch Veränderung des genetischen Codes eines Proteins sogenannte „Peptid-Tags", d. h. kurze Peptidsequenzen wie das Oligohistidin-Tag (His-Tag) einfügen, die dann z. B. mit Nitrilotriessigsäure-Gruppen in Gegenwart von Nickel-Kationen definierte und stabile Komplexe ausbilden.

Wasserlösliche PDI- und TDI-Chromophore, die eine Maleimid-Gruppe für die Markierung von Cysteinen sowie eine Nitrilotriessigsäure-Gruppe für die Reaktion mit einem His-Tag [8] besitzen, konnten dargestellt und für die Markierung von Proteinen erfolgreich eingesetzt werden. Interessanterweise wurde in Gegenwart von Nickel-Kationen keine Änderung der Fluoreszenzquantenausbeute des PDI-Farbstoffs nach Anbindung an das His-Tag beobachtet, was für Studien an einzelnen Proteinen für ein gutes Signal-Rasch-Verhältnis von wesentlicher Bedeutung ist [11].

Rylenfarbstoffe in der Anwendung
Eine der vielseitigsten Kupplungsmethoden für die chemische Modifikation von Proteinen stellt die native chemische Ligation dar, die es erlaubt, insbesondere große Polypeptid-Strukturen effizient zu synthetisieren, die ansonsten nur schwierig zugänglich sind. Hierbei findet eine selektive Verknüpfung von ungeschützten Peptidfragmenten statt, wobei das eine Fragment einen C-terminalen Thioester trägt, während das andere Ende ein N-terminales Cystein aufweist. Der wasserlösliche PDI-Thioester, der eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute und eine exzellente Photostabilität besitzt, erlaubt somit die ortsgerichtete Markierung von thiolhaltigen Proteinen und Peptiden. Dies konnte am Beispiel der Markierung des Lichtsammelkomplexes (LHCII) kürzlich erfolgreich demonstriert werden. Eine biochemische Analyse des Konjugats zeigte, dass die Struktur und Funktion von LHCII nach der N-terminalen Modifikation größtenteils unbeeinflusst blieb [13]. Die erfolgreiche Markierung eines ausgedehnten, komplizierten Multiprotein-Komplexes wie LHCII unterstreicht ferner, wie wichtig eine geringe molekulare Größe sowie die Auswahl der geeigneten, reaktiven Gruppen für die Proteinfunktionalisierung sind. Aufgrund ihrer attraktiven, photophysikalischen Eigenschaften bieten maßgeschneiderte Rylenfarbstoffe somit ein großes Potential, die Funktion von Proteinen, ihre Dynamik in Lösung sowie ihre Wechselwirkungspartner in lebenden Systemen zu untersuchen.

In jüngster Vergangenheit wurde ein neues Konzept der spezifischen Wechselwirkung von Rylenfarbstoffen mit biologischen Strukturen aufgezeigt. Hierfür wurde der Farbstoff PDI von einer steifen Polyphenylen-Hülle umgeben, auf die dann eine zweite hydrophile Hülle folgte, die eine hohe Anzahl positiver oder negativer Ladungen aufwies (Abb. 3) [14, 15]. Derartige dreidimensionale Kern-Schale Architekturen weisen neben einer Größe, die vergleichbar mit der von Proteinen ist, ein hydrophobes Innere mit einem fluoreszenten Kern, sowie eine geladene äußere, hydrophile Hülle auf. In der Natur existieren zahlreiche polykationische oder polyanionische Strukturen. Es konnte anhand von Zellexperimenten gezeigt werden, dass das polyanionische PDI-Kern-Schale Makromolekül P1 mit Histon-Proteinen im Zellkern stabile Komplexe ausbildet und Zellkerne somit spezifisch markiert [15]. Ferner konnten analoge, polykationische Kern-Schale Makromoleküle hergestellt werden, die mit Aggrekan-Strukturen der extrazellulären Matrix wechselwirken und diese als bisher einzige Farbstoffe kontrastreich direkt anfärben können [16]. Diese einzigartigen Eigenschaften sind insbesondere von großem Interesse, wenn Zell-Zell-Interaktionen studiert werden sollen.

Fazit
Die rasanten Entwicklungen in der höchstauflösenden Mikroskopie führten zu einer wahren Renaissance der Synthese leistungsstarker, organischer Fluoreszenzfarbstoffe. Rylenfarbstoffe mit ihren vielfältigen Funktionalisierungsmöglichkeiten und ihren herausragenden optischen Eigenschaften sind insbesondere für Studien an einzelnen Molekülen attraktiv. Durch die Funktionalisierung ihres Gerüsts mit polaren Substituenten werden brillante, photostabile Farbstoffe erhalten, die sich sogar in sehr polaren Lösungsmitteln verwenden lassen. Wird eine weitere reaktive Gruppe in das Rylengerüst eingefügt, die mit spezifischen Aminosäureresten reagieren kann, so eröffnen sich zahlreiche Möglichkeiten, Proteine sogar ortdefiniert und effizient zu markieren. Nanometergroße PDI-Kern-Schale Architekturen erlauben ferner eine kontraststarke Markierung von natürlich vorkommenden Makroionen und Polyelektrolyten.

Insbesondere die jüngsten Weiterentwicklungen in der Mikroskopie in Kombination mit neuen, leistungsstarken Fluoreszenzfarbstoffen werden einzigartige, minimal-invasive Einblicke in die Zellbiologie unter physiologischen Bedingungen ermöglichen, was für grundlegende biologische Fragestellungen und biomedizinische Anwendungen von einem hohem Interesse ist.

Referenzen sind bei den Autoren erhältlich.

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