Molecular Biology meets Food Chemistry

Eine Verbindung mit Zukunft

  • ©Knipseline/Pixelio.de©Knipseline/Pixelio.de
  • ©Knipseline/Pixelio.de
  • Abb. 1. Polymerasekettenreaktion: Zeitliche Abfolge und Temperaturverlauf der einzelnen Reaktionsschritte
  • Abb. 2: Agarosegel zum Nachweis von Vicia faba-Anteilen in dotierten Marzipanrohmassen mittels Endpunkts-PCR. Es ist möglich, auch die geringste Dotierung sicher nachzuweisen.
  • Abb. 3: Amplifikationskurven einer Matrixkalibrierung. Das Ergebnis zeigt, dass trotz der nahen Verwandtschaft von Aprikose und Mandel eine Bestimmung des Aprikosenkern-Anteils mittels real-time PCR mit SYBR Green I möglich ist.
  • Abb. 4. Reaktionsbeginn der LAMP. Die Reaktionsschritte (B-F) sind nur für einen Strang (blau) dargestellt. Die Reaktion findet mit dem Komplementärstrang (orange) analog statt. A: Anordnung der Bindungsbereiche. B: Erzeugung von Einzelsträngen durch thermische Denaturierung; Binden des IP. C: Start der Amplifikation vom hybridisierten IP. D: Binden des ÄP und Amplifikation; Strangverdrängung bei Auftreffen auf in C gebildeten Doppelstrang. E; Ausbildung von Schleifen. Entstehung der ersten Zwischen- und Endprodukte. F: Äquivalente Reaktion (B-E) mit entgegengesetzten Primern. G: Zentraler Reaktionszyklus

Bei der Untersuchung von Lebensmitteln werden neben den vier Hauptkomponenten Lipide, Kohlenhydrate, Proteine und Wasser auch häufig Minorkomponenten, wie Vitamine, Mineralstoffe, Spurenelemente etc. qualitativ und quantitativ bestimmt. Soll bei einem zusammengesetzten Lebensmittel ein tierischer oder pflanzlicher Bestandteil eindeutig identifiziert werden, ist man auf typische Markersubstanzen, wie z. B. charakteristische Primär- oder Sekundärstoffwechselprodukte, wie Fettsäuren, Alkaloide etc. angewiesen. Je näher die Lebensmittelbestandteile miteinander verwandt sind, desto schwieriger wird es, charakteristische Markersubstanzen zu definieren. Vorraussetzung für eine Identifizierung und Quantifizierung des entsprechenden Lebensmittelbestandteiles ist darüber hinaus das Vorhandensein der Markersubstanz in konstanter, definierter Menge. Da jedoch fast alle Lebensmittelbestandteile Stoffwechselprodukte sind, können sie natürlichen Schwankungen, beispielsweise hervorgerufen durch standortbedingte oder klimatische Einflüsse, unterliegen.

Ein Lebensmittelbestandteil, der für jeden Organismus individuell ist und vor allem in konstanten Mengen im Zellkern jeder Zelle vorliegt ist die DNA. Auch bei stark verwandten Organismen ist es häufig möglich Unterschiede in den DNA-Sequenzen der Organismen zu identifizieren. Da die DNA in sehr geringen Mengen im Organismus vorliegt, ist es für die meisten DNA-basierten Analysemethoden allerdings notwendig, die DNA vor der Detektion zu vervielfältigen ohne die Sequenz dabei zu verändern. Dies kann mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgen (Abb. 1). Da die Reaktionskinetik dieser enzymatischen Amplifikation einer mathematischen Formel unterliegt, bietet die PCR neben der abschließenden qualitativen Detektion der DNA auch die Möglichkeit quantitative Aussagen über die DNA-Ausgangsmenge zu machen.

Wurde anfangs lediglich auf die klassische Endpunkts-PCR zur qualitativen Detektion von Lebensmittelbestandteilen zurückgegriffen, halten mittlerweile auch Weiterentwicklungen, wie z. B. die quantitative real-time PCR, die PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) oder die LAMP (loop mediated isothermal amplification) Einzug im Bereich moderner Lebensmittelanalytik.

DNA-Isolierung

Eine Vorraussetzung für eine verlässliche DNA-basierte Analysenmethode ist der Einsatz einer DNA-Extraktionsmethode, die es ermöglicht DNA (i) in ausreichender Menge, (ii) in hoher Reinheit und (iii) möglichst intakt und somit amplifizierbar aus der komplexen Matrix des Lebensmittels zu isolieren.

Standardmethoden zur DNA-Isolierung nutzen hierzu zwei Eigenschaften der DNA. Zum einen ist es möglich DNA z. B. mit Hilfe des Detergenzes Cetyltriammoniumbromid (CTBA) reversibel zu präzipitieren und somit Begleitstoffe abzutrennen. Zum zweiten kann DNA unter Hochsalzbedingungen an Silikamaterialien gebunden und - nach Waschen mit verschiedenen salzhaltigen Puffern - unter Niedrigsalzbedingungen wieder eluiert werden. Gängige Methoden vereinen die CTAB-Fällung mit einer anschließenden Reinigung über Silika-Säulchen. In Abhängigkeit von der Lebensmittelmatrix geht der DNA-Isolierung ein mechanischer und/oder chemischer Aufschluss der Zellen voraus.

Die Polymerasekettenreaktion und ihre Einsatzmöglichkeiten am Beispiel Marzipan

Die „klassischen" Amplifikations-Methoden nutzen in der Regel thermostabile Polymerasen. Die Verwendung dieser thermophilen Enzyme ist nötig, um die drei Temperaturschritte der PCR mittels Thermocycler automatisch ablaufen zulassen.

Zu Beginn der Entwicklung von PCR-Methoden zur Differenzierung von pflanzlichen (oder tierischen) Lebensmittelbestandteilen steht grundsätzlich die Identifikation geeigneter DNA-Sequenzen, die für die Entwicklung von Primern geeignet sind. Üblicherweise wird zunächst eine Datenbankrecherche nach geeigneten Sequenzen durchgeführt. Die Spezifität und die Sensitivität dieser qualitativen Methode beruhen auf selektiv bindenden Primer-Paaren, durch die sowohl der amplifizierte Sequenzabschnitt als auch die Länge des Amplifikats definiert werden. Schwierig ist die Entwicklung spezifischer Nachweise, wenn eine nahe genetische Verwandtschaft zwischen den Arten besteht und nur wenige Sequenzen zur Verfügung stehen. Die Anwendung der PCR hat in den letzten Jahren auf dem Gebiet der Lebensmittelanalytik sehr an Bedeutung gewonnen. Beispielsweise werden mittels PCR gentechnisch veränderte Organismen in Lebensmitteln nachgewiesen. Am Institut für Lebensmittelchemie der Universität Hamburg werden seit einigen Jahren qualitative und quantitative PCR-Methoden zur Qualitätsbeurteilung von Lebensmitteln bearbeitet. U.a. wurden Methoden entwickelt, die zur Reinheitskontrolle von Marzipanrohmassen (MRM) auf der Ebene der Rohwaren, der Halbfertig- oder der Endprodukte geeignet sind. Die Fragestellung gründet auf der Tatsache, dass bei der Herstellung von Marzipanrohmassen nur süße Mandeln verwendet werden dürfen, ein Zusatz von geringen Mengen Bittermandeln ist lediglich für die Geschmacksgebung zulässig. Die bewusste Verwendung von anderen pflanzlichen Produkten ist nicht zulässig. Bei der Persipanrohmassenherstellung dagegen dürfen sowohl entbitterte Aprikosen- und Pfirsichkerne aber auch entbitterte bittere Mandeln eingesetzt werden. Stellt ein Betrieb zum Beispiel neben MRM auch Persipanrohmassen her, kann es zu einem ungewollten Eintrag von Aprikosenkernen kommen. Solche Verunreinigungen liegen in der Regel in geringen Konzentrationen vor und Aprikose und Pfirsich sind zudem nahe mit der Mandel verwandt (alle Gattung Prunus). Hieraus entstehen besondere Ansprüche an die Spezifität und Sensitivität der analytischen Methode.

Die PCR zeichnet sich generell durch eine hohe Spezifität, die in der Individualität der DNA-Sequenz begründet, liegt aus und ist dadurch anderen Methoden, die bislang zur Unterscheidung von Marzipan und Persipan angewendet wurden, überlegen. Die Spezifität der Nachweise muss durch die Optimierung der DNA-Isolierung, sowie der Reaktionsbedingungen der PCR gewährleistet und in sog. Kreuztest belegt werden. Für Kreuztests werden DNA-Isolate verschiedener relevanter Pflanzenarten zur PCR eingesetzt. Es sollte für die nachzuweisende Pflanzenart ein spezifisches PCR-Produkt beobachtet werden.

Für qualitative Nachweise werden die PCR-Produkte nach der Reaktion detektiert. Üblicherweise erfolgt eine Trennung mittels Agarosegelelektrophorese und anschließender visueller Auswertung der Gele. Abbildung 2 zeigt die Messung einer mit Bohnenmehl (Vicia faba) dotierten MRM. Das Beispiel zeigt, dass Endpunkts-Methoden geringe Nachweisgrenzen besitzen und so für viele Fragestellung ausreichen. Zur quantitativen Bestimmung eignet sich die Detektion am Ende der Reaktion nur bedingt, da die PCR in einem Plateau endet und die Konzentration des Produktes nicht direkt mit der eingesetzten Menge bzw. dem Anteil der vorliegenden Verunreinigung korreliert.

Quantitative Methoden werten die Reaktion zu früheren Zeitpunkten aus. Dazu erfolgt die fluorimetrische Messung der Zunahme der DNA in Echtzeit (engl. real-time) während der PCR. Hierzu sind Thermocycler mit der optischen Ausstattung für die Messung der Fluoreszenz nötig. Da die DNA jedoch selbst nicht fluoresziert, müssen dem Reaktionsansatz Fluorophore zugesetzt werden. Häufigen Einsatz finden mit Fluorophoren markierte Sonden. Diese Sonden enthalten i.d.R. neben dem Fluorophor einen Quencher oder einen weiteren Fluorophor, der die Fluoreszenz durch FRET (Fluorescence resonance energy transfer) zunächst abfängt. Werden z. B. TaqMan-Sonden verwendet, werden während der PCR der Fluorophor und der Quencher räumlich getrennt, so dass eine Fluoreszenz messbar wird. Da diese Sonden Sequenz-abhängig entwickelt werden können, hängt die Spezifität der Nachweise nicht mehr ausschließlich von der Primersequenz ab.
Ist die Spezifität der Nachweise allein durch die Primer gewährleistet, können auch Interkalationsfluorophore verwendet werden. Häufig wird SYBR Green I (SG) verwendet. Bei Anwesenheit von doppelsträngiger DNA interkaliert das SG, was zu einer starken Zunahme der Fluoreszenz führt. Die Auswertung der real-time Messungen erfolgt über den PCR-Zyklus an dem ein bestimmter Fluoreszenzwert überschritten wird. Das Erreichen dieses Schwellenwertes hängt mit der Menge an Ausgangs-DNA zusammen. Abbildung 3 zeigt das Ergebnis einer real-time PCR-Messung von in verschiedenen Graden mit Persipanrohmasse dotierter MRM. Die Berechnung der nachzuweisenden pflanzlichen Verunreinigung kann nach verschiedenen Modellen erfolgen. Häufig wird eine externe Kalibriergerade parallel vermessen und über diese die Konzentration berechnet. Gute Ergebnisse liefern auch relative Auswertungsmethoden, bei denen die Konzentrationen in Bezug auf eine Referenz berechnet werden. Entscheidend für die Richtigkeit der Ergebnisse ist, dass die als Reaktionseffizienz im Standard und in der Probe möglichst gleich ist. Die Reaktionseffizienz kann durch die Matrix stark beeinflusst werden. Um genaue und richtige Ergebnisse in komplexen Lebensmitteln zu erzielen, sollten aufwendige Matrixkalibrierungen durchgeführt werden.

Alternative zur klassischen PCR: Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP)

Andere Methoden zur selektiven Amplifikation von DNA sind ebenfalls für den spezifischen Nachweis von Organismen geeignet. Ein Beispiel ist die sog. loop-mediated isothermal amplification (LAMP), die in unserem Institut derzeit für eine Reihe spezieller lebensmittelanalytischer Fragestellungen, wie z.B. zur Differenzierung von Gewürzen, entwickelt wird. Der Vorteil isothermaler Methoden gegenüber der PCR stellt sich zunächst durch einen geringeren apparativen Aufwand dar. Ein isothermaler Reaktionsverlauf bietet die Möglichkeit die Reaktion nicht in einem Thermocycler sondern beispielsweise in einem Wasserbad o.ä. ablaufen zu lassen. Eine solche Vereinfachung kann in Verbindung mit einer entsprechend einfachen Detektion für eine solche Methode die Unabhängigkeit von einem Labor bedeuten. Somit liegt ein sehr großes Potential für isothermal amplifizierende Reaktionen in der Entwicklung von Methoden, die direkt vor Ort (in the field) eingesetzt werden können. Die LAMP kann unter isothermalen Bedingungen durchgeführt werden, da Polymerasen eingesetzt werden, die über ausgeprägte Strangverdrängungsaktivitäten verfügen und gleichzeitig keinerlei Exonukleaseaktivitäten zeigen. Die amplifizierende Polymerase ist in der Lage gebildete Doppelstränge selbstständig in amplifizierbare Einzelstränge zu trennen. Um diese Fähigkeiten für die LAMP ausnutzen zu können bedarf es eines komplexen Primersystems. Es sind, im Gegensatz zu den zwei Primern für eine PCR, mindestens vier Primer für eine LAMP nötig (s. Abb. 4). Die sog. inneren Primer (IP) enthalten Sequenzen aus zwei Bindungsstellen (BS) die auf der Zielsequenz zu finden sein müssen. Das 3'-Ende des IP besteht aus einem komplementären Sequenzabschnitt (BS2) und verhält sich ähnlich wie die Primer in einer PCR. Das 5'-Ende des IP enthält einen Sequenzabschnitt (BS1) des Zielstrangs, der etwa 40 bp weiter in 3'-Richtung als die BS2 auf dem Zielstrang zu finden sein muss. Erfolgt eine Bindung des IP mit der BS2 auf dem Zielstrang kann eine Amplifikation erfolgen. Hierbei wird ebenfalls die BS1 amplifiziert. Um erneut Einzelstränge zu erzeugen wird das zweite Primerpaar benötigt. Die sog. äußeren Primer (ÄP) entsprechen einem Primersatz aus der klassischen PCR und flankieren den oben beschrieben Bereich aus BS1 und BS2. Eine Bindung der ÄP an BS3 führt ebenfalls zu einer Amplifikation und einer Strangverdrängung durch die amplifizierende Polymerase. Der in der zuerst beschriebenen Reaktion entstandene Doppelstrang wird dadurch in Einzelstränge getrennt. Auf BS1, die nun einzelsträngig vorliegt, kann das 5'-Ende des IP binden. So bildet sich eine schleifenartige Struktur aus. Diese Struktur enthält durch die Amplifikation der entsprechenden Bereiche am 3'-Ende die BS der entgegengesetzten Primerbindungsbereiche. Die beschriebenen Reaktionen können also komplementär noch einmal genauso ablaufen. Hierdurch entsteht als Reaktionsprodukt eine einzelsträngige hantelförmige Struktur mit jeweils einer Schleife an den Enden. Diese hantelförmige Struktur und das dazu komplementäre Reaktionsprodukt stellen zentrale Elemente der Reaktion dar. Sie enthalten BS für die inneren Primer und führen zu weiteren Amplifikationen. Hierdurch wird, über verschiedene Reaktionsprodukte, aus der hantelförmigen Struktur die entsprechende Komplementärstruktur gebildet. Dieser Vorgang lässt sich also als ein Reaktionszyklus ansehen, in dem die hantelförmigen Strukturen regeneriert werden. Die Reaktion läuft ab hier unabhängig von den ÄP ab, so dass diese nur für die Initiation der Reaktion benötigt werden. Außerdem entstehen in dem zentralen Reaktionszyklus weitere Strukturen, welche ebenfalls die BS2 enthalten. Es wird eine Reaktionskaskade ausgelöst in der immer komplexere Reaktionsprodukte mit BS2 entstehen. Die Komplexität dieser Reaktionsprodukte führt zu einem deutlich größeren Substratumsatz verglichen mit der PCR. Bei der Polymerisierung der Desoxynukleosidtriphosphate zu Nukleinsäuren entsteht als Nebenprodukt Pyrophosphat, welches mit den im Reaktionsgemisch enthaltenen Magnesiumionen eine schwerlösliche Verbindung eingeht. Durch den hohen Stoffumsatz bei der LAMP ist es daher möglich positive Reaktionen anhand einer Trübung zu detektieren. Diese einfache Form der Detektion in Verbindung mit dem isothermalen Reaktionsverlauf macht die LAMP unabhängig von Laboratorien.

Fazit

Spezifität und Sensitivität sind wichtige Eckpunkte bei der Analytik von Lebensmitteln. Je größer die Sequenzbereiche für die Bindung von Sonden oder Primern sind, umso spezifischer ist die Reaktion. Die Länge der eingesetzten Primer (Sonden) wird aber durch physikalische Randbedingungen - die Annealingtemperatur sollte einen bestimmten Höchstwert nicht überschreiten - begrenzt. Hilfreich ist hierbei die Verwendung mehrerer Oligonukleotide, die einen größeren Sequenzbereich abdecken können, ohne aber Einfluss auf die Annealingtemperatur zu nehmen. So wird bei einer Taqman-PCR neben den beiden Primern noch eine Sonde verwendet. Die erreichte Spezifität ist dabei höher verglichen mit einer klassischen PCR. Die LAMP arbeitet sogar mit 6 Primerbindungsstellen, sie ist damit im Punkt Spezifität der PCR weit überlegen.

Möchte man den apparativen Aufwand möglichst gering halten, so kann die LAMP im Vergleich zur PCR auch hier punkten, da die LAMP sogar unter isothermalen Reaktionsbedingungen ablaufen kann. Des weiteren kann die Detektion bei der LAMP aufgrund des äußerst hohen Substratumsatzes über die durch das als Nebenprodukt gebildete Pyrophosphat entstehende Trübung erfolgen (Turbidimetrie). Die Verwendung von teuren Fluorophoren in Verbindung mit entsprechend aufwendigen PCR-Maschinen kann also entfallen.

Autor(en)

Kontaktieren

Universität Hamburg - Institut für Lebensmittelchemie
Grindelallee 117
20146 Hamburg
Deutschland

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.