Molekulare Prozesse im DNA-Nanolabor

DNA-Nanostrukturen für die Analytik

  • Abb. 1: Schematische Darstellung der Faltung eines DNA-Origami-Dreiecks aus einem Gerüststrang und etwa 200 synthetischen Klammersträngen. Die DNA-Origami-Strukturen dienen als Plattformen zur Bestimmung von DNA-Strangbruchausbeuten nach Bestrahlung z. B. mit Elektronen, für die oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS), und für Untersuchungen mittels Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET).Abb. 1: Schematische Darstellung der Faltung eines DNA-Origami-Dreiecks aus einem Gerüststrang und etwa 200 synthetischen Klammersträngen. Die DNA-Origami-Strukturen dienen als Plattformen zur Bestimmung von DNA-Strangbruchausbeuten nach Bestrahlung z. B. mit Elektronen, für die oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS), und für Untersuchungen mittels Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET).
  • Abb. 1: Schematische Darstellung der Faltung eines DNA-Origami-Dreiecks aus einem Gerüststrang und etwa 200 synthetischen Klammersträngen. Die DNA-Origami-Strukturen dienen als Plattformen zur Bestimmung von DNA-Strangbruchausbeuten nach Bestrahlung z. B. mit Elektronen, für die oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS), und für Untersuchungen mittels Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET).
  • Abb. 2: Bestimmung von DNA-Strangbruchausbeuten bei Bestrahlung mit 18 eV Elektronen. Als Beispiel dient ein DNA-Nanoarray mit neun Zielsequenzen. Die intakten Zielsequenzen erscheinen als helle Punkte im AFM-Bild, und eine statistische Analyse vor und nach der Bestrahlung liefert die Wirkungsquerschnitte für DNA-Strangbrüche [5].
  • Abb. 3: Nachweis einzelner Moleküle auf DNA-Origami-Strukturen durch SERS. DNA-bedeckte Gold-Nanopartikel werden an definierte Stellen auf den DNA-Nanostrukturen hybridisiert (der DNA-Mantel der AuNPs wurde auf den DNA-Nanostrukturen der Übersicht halber weggelassen), und einzelne Analyt-Moleküle können an bestimmte Stellen in den SERS-Hotspots platziert und vermessen werden [6].

DNA ist für ihre biologische Funktion als Träger der Erbinformation bekannt, kann aber darüber hinaus auch hervorragend als Material zur Herstellung von Nanostrukturen verwendet werden. Dies gelingt durch die hochspezifische Bindung zwischen den Nukleinbasen durch Wasserstoffbrücken, die es zwei DNA Einzelsträngen mit komplementärer Basenfolge ermöglicht, zu einem Doppelstrang mit hoher Steifigkeit zu hybridisieren. Bei der DNA-Origami-Technik wird ein langer DNA-Einzelstrang mit Hilfe von „Klammersträngen" in beliebige Formen gefaltet. Die Technik wurde von Paul Rothemund im Jahr 2006 entwickelt und erlaubt das Fertigen von komplexen DNA-Nanostrukturen wie Rechtecken und Dreiecken in einer Größenordnung von 100 nm [1]. Als Gerüst wird einzelsträngige zirkuläre M13mp18-Viren-DNA mit einer Länge von 7249 Nukleotiden verwendet, deren Basensequenz genau bekannt ist. Kurze synthetische Oligonukleotide mit geeigneter Basenfolge dienen als Klammerstränge und können zwischen zwei bis drei Stellen des Gerüststranges eine Verbindung erzeugen. Die Faltung eines Dreiecks aus dem Gerüststrang ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt.

Zum Herstellen der gewünschten Struktur wird der Gerüststrang mit 200 Klammersträngen in einer geeigneten Pufferlösung zusammengegeben, die die DNA für das Bilden der Doppelhelix benötigt. Die gewünschte Nanostruktur entsteht durch Selbstassemblierung. Die Form der Objekte ist jeweils durch die Wahl der Klammerpositionen festgelegt. Ein großer Vorteil der DNA-Origami-Technik ist, dass auf exakte Stöchiometrie verzichtet werden kann, da die kostengünstigen Klammerstränge im Überschuss verwendet werden. Paul Rothemund beschrieb es so: „It‘s like being able to bake a cake and not pay attention to the ingredient ratios" [2].

In unserer Arbeit verwenden wir dreieckige DNA-Origami-Strukturen als ein Reißbrett auf Nanometerskala, indem Klammerstränge mit Modifikationen an wohldefinierten Positionen im DNA-Origami eingebaut werden. Diese Modifikationen können im einfachsten Fall DNA-Verlängerungen sein. Damit können zum Beispiel spezifische DNA-Sequenzen in einem vorgegebenen Muster auf einer DNA-Origami-Plattform angeordnet werden und sogenannte DNA-Nanoarrays ausbilden.

Diese DNA-Nanoarrays können zum Beispiel zur Bestrahlung mit Elektronen oder Photonen verwendet werden, um Wirkungsquerschnitte für strahleninduzierte DNA-Strangbrüche in spezifischen DNA-Sequenzen zu bestimmen. Weiterhin können beispielsweise Gold-Nanopartikel (AuNP) an die DNA-Origami-Plattformen gebunden werden. Mithilfe dieser Hybridstrukturen können prinzipiell einzelne Moleküle mittels oberflächenverstärkter Raman-Streuung (engl. surface enhanced Raman scattering (SERS)) nachgewiesen werden. Durch Bindung von verschiedenen Farbstoffmolekülen in definierten Abständen an die DNA-Origami-Strukturen können auch fluoreszenzbasierte Detektionsschemata entwickelt werden. Eine Übersicht dieser Anwendungsmöglichkeiten von DNA-Origami-Strukturen ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Origami-Strukturen adsorbieren leicht auf Oberflächen wie Glimmer oder Silizium, so dass sie mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (engl. atomic force microscopy (AFM)) sichtbar gemacht werden können.

Bestimmung von strahlungsinduzierten DNA-Strangbruchausbeuten
In der Tumor-Strahlentherapie wird hochenergetische Strahlung verwendet, um Tumorgewebe gezielt abzutöten. Ein tiefgreifendes Verständnis der Mechanismen der DNA-Strahlenschädigung wird zu einer Optimierung der Strahlentherapie beitragen. DNA wird aber nicht nur durch die hochenergetische Strahlung selbst, sondern hauptsächlich von hochreaktiven Sekundärteilchen geschädigt, die durch die Radiolyse von Wasser entstehen. Dazu gehören zum Beispiel Elektronen niedriger Energie (<20 eV), die die DNA durch dissoziative Elektronenanlagerung sehr effektiv schädigen können [3]. Die Effektivität der Elektronen-induzierten Entstehung von DNA-Strangbrüchen hängt von der DNA-Sequenz ab, und eine genaue Kenntnis dieses Effektes kann zu einer Weiterentwicklung von therapeutisch eingesetzten Radiosensibilisatoren führen. Dafür ist die Bestimmung von Wirkungsquerschnitten für DNA-Strangbrüche für verschiedene DNA-Sequenzen und DNA-Strukturen notwendig. Die Bestimmung dieser Wirkungsquerschnitte ist aber mit herkömmlichen Techniken der analytischen Chemie kaum möglich, da die Menge an durch Strahlung geschädigtem DNA-Material zu gering ist.

Mithilfe von DNA-Origami basierten DNA-Nanoarrays ist es nun möglich, strahlungsinduzierte DNA-Strangbrüche von Oligonukleotiden definierter Sequenz auf Einzelmolekül-Niveau zu verfolgen. Dafür werden die zu untersuchenden Zielsequenzen auf den DNA-Nanoarrays mit Biotin modifiziert. Die immobilisierten Strukturen werden unter definierten Bedingungen bestrahlt und anschließend mit Streptavidin inkubiert, um die noch intakten DNA-Stränge für eine anschließende AFM-Analyse sichtbar zu machen [4, 5]. Hierbei werden DNA-Strangbrüche nur in den Zielsequenzen (also den Verlängerungen von ausgewählten Klammersträngen) detektiert. Die DNA-Origami-Struktur dient nur als Plattform zur Anordnung der Zielsequenzen, die eine quantitative Analyse erst ermöglicht. Ein Beispiel der Technik ist in Abbildung 2 dargestellt, wobei neun Zielsequenzen auf einem DNA-Origami-Dreieck angeordnet wurden [4]. Beispiele für AFM-Aufnahmen sind für eine unbestrahlte Kontrollprobe (Abb. 2a) und eine Probe gezeigt, die mit einer definierten Fluenz von 18 eV Elektronen bestrahlt wurden (Abb. 2b). Die intakten Zielsequenzen sind als helle Punkte auf den Dreiecken sichtbar. Eine Analyse von einigen hundert Dreiecken zeigt die Verteilung der intakten Zielsequenzen für die Kontrollprobe (Abb. 2c) und die bestrahlte Probe (Abb. 2d). Aus der Analyse von Proben bei verschiedenen Fluenzen kann die Strangbruchausbeute für die Zielsequenzen bestimmt werden (Abb. 2e). Aufgrund der Einzelmolekül-Technik entsprechen die Strangbruchausbeuten den absoluten Wirkungsquerschnitten für DNA-Strangbrüche. Mit dieser Technik ist es nun möglich, die Wirkungsquerschnitte effektiv für eine große Anzahl DNA-Sequenzen und Bestrahlungsbedingungen zu untersuchen.

Oberflächenverstärkte Raman-Streuung
Die Möglichkeit sowohl plasmonische Metallstrukturen als auch Analytmoleküle mit nm-Präzision anzuordnen, macht DNA-Origami-Substrate zu hervorragenden Templaten für SERS. Grundlage dieser Methode bildet die gezielte Anregung der Oberflächenplasmonresonanz von Metallstrukturen (meist Gold, Silber oder Kupfer), die zu einer elektromagnetischen Feldverstärkung und damit auch zur Verstärkung des von Natur aus sehr schwachen Raman-Signals führt. Besonders hohe Verstärkungsfaktoren können durch Plasmonkopplung nah benachbarter Metallstrukturen erreicht werden.

Einer unserer Forschungsbereiche verknüpft die SERS-Spektroskopie mit der DNA-Origami-Methode für gezielte Einzelmolekülmessungen [6]. Hierzu werden sowohl DNA-funktionalisierte AuNP als auch Analytmoleküle mittels DNA-Hybridisierung an verlängerte DNA-Einzelstränge der DNA-Origami-Template gebunden. Auf diese Weise kann eine Anordnung von AuNP-Dimeren mit definiertem Abstand erreicht werden (Abb. 3a). Durch die Plasmonkopplung der beiden AuNPs wird ein lokalisierter Hot Spot maximaler Feldverstärkung erzeugt (Abb. 3b), der die Detektion von Raman-Reporter-Molekülen wie beispielsweise Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) mittels SERS ermöglicht [6].

Die rote Kurve in Abb. 3c ist als Referenz dargestellt und zeigt das SERS-Spektrum von etwa 102 - 103 TAMRA-Molekülen mit den für TAMRA charakteristischen Banden bei 1647, 1534, 1509, 1356 und 1215 cm-1. Durch Anpassen der Größe und des Abstandes der AuNPs wurde der Hot Spot optimiert und somit die Detektionsgrenze auf ein einziges TAMRA-Molekül pro AuNP-Dimer reduziert. In Abbildung 3c (blaue Kurve) ist das SERS-Spektrum von DNA-Origami-Templaten mit jeweils einem einzigen TAMRA-Molekül zwischen zwei 25 nm AuNPs dargestellt. Die charakteristische TAMRA-Bande bei 1647 cm-1 ist hierbei weiterhin detektierbar. Korrelierte AFM-Messungen (Abb. 3d) haben gezeigt, dass maximal 17 einzelne DNA-Dreiecke und damit maximal 17 TAMRA-Moleküle zu dem blauen SERS-Spektrum beitragen. Die herausragenden Vorteile der hier angewendeten Technik gegenüber herkömmlichen SERS-Experimenten sind sowohl die Quantifizierung der Analytkonzentration im Hot Spot als auch die kontrollierte Anordnung der plasmonischen Strukturen.

Förster-Resonanzenergietransfer auf DNA-Origami-Strukturen
Mit Hilfe der DNA-Origami-Strukturen können organische Farbstoffe in unterschiedlichen Abständen zueinander platziert werden, um Untersuchungen zum Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) durchzuführen. FRET ist ein strahlungsloser Energietransfer, bei dem die Energie eines angeregten Donors auf einen Akzeptor über Dipol-Dipol-Wechselwirkungen übertragen wird. Dieser Prozess ist von den spektralen Eigenschaften der organischen Farbstoffe und deren Abständen zueinander abhängig. Durch Einbau eines Telomer-DNA-Stranges kann der Abstand zwischen den Farbstoffen in situ durch Zugabe bestimmter Kationen verändert werden. Telomere bilden in Gegenwart von einwertigen Kationen, wie Kalium und Natrium Guanin-Quadruplexe aus, wobei der Abstand zwischen Akzeptor und Donor verringert wird und die FRET-Effizienz steigt. Die DNA-Origami-Strukturen blockieren spezifische G-Quadruplex-Strukturen durch sterische Hinderung, wodurch ein Kalium-selektiver Sensor entsteht, der sogar bei hoher Natriumkonzentration seine Selektivität beibehält.

Literatur
[1] Rothemund P.W.K. Nature 440, 297 (2006)
[2] Sanderson K. Nature 464, (2010)
[3] Baccarelli I. et al.: J. Phys. Rep. 508, 1.(2011)
[4] Keller A. et al.: ACS Nano 6, 4392. (2012)
[5] Keller A. et al.: New J. Phys. 15, 14. (2013)
[6] Prinz J. et al.: J. Phys. Chem. Lett. 4, 4140-4145 (2013)

Autoren
Christian Heck, Lydia Olejko, Julia Prinz,
Robin Schürmann, Ilko Bald

Kontakt
JProf. Ilko Bald
BAM Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung
Abteilung 1: Analytische Chemie und Referenzmaterialien
Berlin

Institut für Chemie - Physikalische Chemie
Universität Potsdam
www.uni-potsdam.de/osci

Weitere Beiträge zum Thema: www.git-labor.de/category/tags/nanotechnologie
Mehr Informationen: www.imaging-git.com

 

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