Nanoauflösung

Präzisionsproteintuning und Einzelmoleküldarstellung

  • Abb. 1: Auswahl biokompatibler Markierungsreaktionen, die mit handelsüblichen Farbstoffderivaten möglich sind: Maleimid-Kopplung mit den Thiolen von Cysteinen und Succinimidylester-Kopplung, z. B. mit Aminen vom Lysin, sind die gebräuchlichsten Methoden zur Markierung von Proteinen. Aufgrund der großen Anzahl dieser Aminosäuren lassen sie jedoch normalerweise keine ortsspezifische Markierung zu. Oxim-Ligation tritt zwischen Ketonen/Aldehyden mit Hydrazid-/Hydroxylamin-Farbstoffderivaten auf. Kupfer-katalysierte Alkinen-Azid-Click-Reaktion (CuAAC) erfolgt zwischen Aziden und Alkinen, und Farbstoffderivate sind im Handel häufig mit Alkinen und Aziden erhältlich (die Reaktion ist für beide Fälle angegeben). Azid-Alkin-Cycloadditionen unter Abbau von Ringspannung (SPAAC) treten zwischen gespannten Alkinen- und Azid-Farbstoffderivaten auf. Ein paar Farbstoffe sind auch als Alkine mit Ringspannung, vorwiegend als „DIBO”-Derivate, erhältlich, die die Farbstoffeigenschaften stark beeinflussen und sie sehr „klebrig“ machen. Somit stellt die Kodierung des gespannten Alkins und die Verwendung des leicht zu handhabenden Azid-Farbstoffes einen Vorteil dar. Die unter Abbau von Ringspannung erfolgende Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (SPIEDAC) ist aufgrund ihrer wahrscheinlichen zukünftigen Relevanz aufgeführt, auch wenn derzeit die kommerzielle Verfügbarkeit geeigneter Farbstoffderivate eingeschränkt ist. Chemische Ligation ist aufgrund ihrer Bedeutung und des häufigen Einsatzes dieses Verfahrens aufgelistet. Die meisten Farbstoffe müssen jedoch zunächst in einem Extraschritt gekoppelt werden, z. B. an ein Peptid mit einem N-terminalen, freien Cystein.Abb. 1: Auswahl biokompatibler Markierungsreaktionen, die mit handelsüblichen Farbstoffderivaten möglich sind: Maleimid-Kopplung mit den Thiolen von Cysteinen und Succinimidylester-Kopplung, z. B. mit Aminen vom Lysin, sind die gebräuchlichsten Methoden zur Markierung von Proteinen. Aufgrund der großen Anzahl dieser Aminosäuren lassen sie jedoch normalerweise keine ortsspezifische Markierung zu. Oxim-Ligation tritt zwischen Ketonen/Aldehyden mit Hydrazid-/Hydroxylamin-Farbstoffderivaten auf. Kupfer-katalysierte Alkinen-Azid-Click-Reaktion (CuAAC) erfolgt zwischen Aziden und Alkinen, und Farbstoffderivate sind im Handel häufig mit Alkinen und Aziden erhältlich (die Reaktion ist für beide Fälle angegeben). Azid-Alkin-Cycloadditionen unter Abbau von Ringspannung (SPAAC) treten zwischen gespannten Alkinen- und Azid-Farbstoffderivaten auf. Ein paar Farbstoffe sind auch als Alkine mit Ringspannung, vorwiegend als „DIBO”-Derivate, erhältlich, die die Farbstoffeigenschaften stark beeinflussen und sie sehr „klebrig“ machen. Somit stellt die Kodierung des gespannten Alkins und die Verwendung des leicht zu handhabenden Azid-Farbstoffes einen Vorteil dar. Die unter Abbau von Ringspannung erfolgende Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (SPIEDAC) ist aufgrund ihrer wahrscheinlichen zukünftigen Relevanz aufgeführt, auch wenn derzeit die kommerzielle Verfügbarkeit geeigneter Farbstoffderivate eingeschränkt ist. Chemische Ligation ist aufgrund ihrer Bedeutung und des häufigen Einsatzes dieses Verfahrens aufgelistet. Die meisten Farbstoffe müssen jedoch zunächst in einem Extraschritt gekoppelt werden, z. B. an ein Peptid mit einem N-terminalen, freien Cystein.
  • Abb. 1: Auswahl biokompatibler Markierungsreaktionen, die mit handelsüblichen Farbstoffderivaten möglich sind: Maleimid-Kopplung mit den Thiolen von Cysteinen und Succinimidylester-Kopplung, z. B. mit Aminen vom Lysin, sind die gebräuchlichsten Methoden zur Markierung von Proteinen. Aufgrund der großen Anzahl dieser Aminosäuren lassen sie jedoch normalerweise keine ortsspezifische Markierung zu. Oxim-Ligation tritt zwischen Ketonen/Aldehyden mit Hydrazid-/Hydroxylamin-Farbstoffderivaten auf. Kupfer-katalysierte Alkinen-Azid-Click-Reaktion (CuAAC) erfolgt zwischen Aziden und Alkinen, und Farbstoffderivate sind im Handel häufig mit Alkinen und Aziden erhältlich (die Reaktion ist für beide Fälle angegeben). Azid-Alkin-Cycloadditionen unter Abbau von Ringspannung (SPAAC) treten zwischen gespannten Alkinen- und Azid-Farbstoffderivaten auf. Ein paar Farbstoffe sind auch als Alkine mit Ringspannung, vorwiegend als „DIBO”-Derivate, erhältlich, die die Farbstoffeigenschaften stark beeinflussen und sie sehr „klebrig“ machen. Somit stellt die Kodierung des gespannten Alkins und die Verwendung des leicht zu handhabenden Azid-Farbstoffes einen Vorteil dar. Die unter Abbau von Ringspannung erfolgende Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (SPIEDAC) ist aufgrund ihrer wahrscheinlichen zukünftigen Relevanz aufgeführt, auch wenn derzeit die kommerzielle Verfügbarkeit geeigneter Farbstoffderivate eingeschränkt ist. Chemische Ligation ist aufgrund ihrer Bedeutung und des häufigen Einsatzes dieses Verfahrens aufgelistet. Die meisten Farbstoffe müssen jedoch zunächst in einem Extraschritt gekoppelt werden, z. B. an ein Peptid mit einem N-terminalen, freien Cystein.
  • Abb. 2: Überblick über Markierungsstrategien. Das grüne Symbol ist der Farbstoff, und die rote Form das Protein. Für die Enzymstrategien ist die Rolle des Enzyms ebenfalls aufgezeichnet. Es kann Teil des Tags selbst sein (orangefarbene Form im 2-Komponenten-System) oder eine Hilfsreagenz (blaue Form im 3-Komponenten-System).
  • Abb. 3: Klassifizierung von Einzelmolekül-FRET und superauflösenden Farbstoffen. Dargestellt sind Farbstoffe, die in verschiedenen hochauflösenden Einzelmolekül-FRET-Proteinfaltstudien eingesetzt werden.
  • Abb. 4: Kombiniertes Einzelmolekül-Fluoreszenz-Imaging und Spektroskopie. Das Beispiel zeigt Kernporenkomplexe. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Imaging und Spektroskopie liefern komplementäre Informationen. Während FRET kombiniert mit Einzelpartikel-Tracking individuellen Moleküle folgen und gleichzeitig deren Konformationsänderungen untersuchen kann, bietet die superauflösende Mikroskopie ein räumlich aufgelöstes Bild einer Struktur. Zu jeder bestimmten Position eines Moleküls innerhalb der Zelle kann FRET eine Entfernungsmessung und somit Strukturinformationen liefern.

Obwohl die Einzelmolekülbeobachtung zum Standard geworden ist, erschwert das Fehlen geeigneter Fluoreszenz-Reportersysteme größere wissenschaftliche Durchbrüche. Wir zeigen auf, wie die Forschungsbereiche der chemischen Biologie und der Fluoreszenz-Nanoskopie sich gegenseitig beeinflussen können, um durch Synergie eine Zukunftstechnologie zu fördern, die die Lokalisierung, Struktur und Dynamik von molekularen Systemen ohne Einschränkungen sichtbar machen kann.

Die Fähigkeit sichtbaren Lichts, nicht-invasiv biologische Proben zu durchdringen, brachte eine Vielzahl mikroskopischer und spektroskopischer Verfahren hervor. Es ist erst gut 20 Jahre her, dass erstmals die optische Entdeckung eines Einzelmoleküls in der Kondensationsphase gelang [2, 3]. Vor etwa 15 Jahren wurde das erste Einzelmolekül-Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Experiment durchgeführt [4]. Zukünftige Entwicklungen werden uns in die Lage versetzen, mehr Farben mit höherer zeitlicher und räumlicher Auflösung zu erfassen und dadurch tiefer in molekulare Mechanismen einzublicken.

Die Wahl der Fluoreszenz-Marker und ihre Platzierung am Biomolekül bestimmen letztendlich die Stärke der Methode. Seit den ersten Theorien vom Überwinden der beugungsbegrenzten Abbildung [6] sind einige Entwicklungen der lokalisationsbasierten Mikroskopie überraschend einfach umzusetzen [7-9]. Ein Höhepunkt in der hochauflösenden Mikroskopie war die Erkenntnis, dass Ein- und Ausschalten von fluoreszenten Farbstoffen und die sequentielle Bestimmung der Position zu Bildern mit einer Auflösung kleiner als das Beugungslimit führen. Seitdem hat man bessere Fluoreszenzsonden mit besseren Schalt-Eigenschaften entwickelt.

Autofluoreszenzproteine (AFPs) haben große Auswirkungen auf die biomedizinische Fluoreszenz-Grundlagen- und Anwendungsforschung [10]. AFP-basierte Fusionsproteine sind genetisch kodiert, und ihre Herstellung wird von der Wirts-Maschinerie übernommen. AFPs verfügen jedoch nicht über die Stabilität und die überlegenen photophysikalischen Eigenschaften, die viele der kleineren synthetischen Farbstoffe zu bieten haben. Es besteht deshalb ein dringender Bedarf an besseren Fluoreszenzfarbstoffen zur Markierung von Proteinen.

Instrumente zur Erfüllung dieser Anforderung sind semi-genetische/semi-synthetisch. Zunächst wird die Wirtszelle so manipuliert, dass eine einzigartige chemische Reaktivität in das Protein eingebaut wird. Diese kann dann mit einem synthetischen Farbstoffderivat reagieren, wodurch ein stabiles, fluoreszentes Konjugat entsteht.

Präzisionsproteintuning
Die ideale Sonde muss kleiner sein als ein AFP, sollte eine viel höhere Photostabilität aufweisen und einfach genetisch zu kodieren sein.

Die Stabilität des Farbstoffs ist sehr wichtig für die Eignung als Reporter für z. B. Position oder Konformation von Proteinen. Jede heterogen markierte Probe oder unkontrollierte Veränderungen der Umgebung können das Messergebnis gefährden. Dies begrenzt auf etwa ein Dutzend im Handel erhältliche Kleinmolekülfarbstoffe, wobei nur etwa fünf für das Labeling geeignet sind: Succinimide, Maleimide, Hydrazide oder Hydroxylamine, Alkyine und Azide (Abb. 1). Succinimide reagieren schnell mit Aminogruppen, z. B. von Lysinen und Maleimide mit Thiolen von Cysteinen. Hydrazide und Hydroxylamine können spezifische Oxim-Ligationen mit Ketonen und Aldehyden eingehen, die in der Regel unter sauren Bedingungen schneller ablaufen [11]. Azide und Alkine können (3+2) Huisgen-Cycloadditionen eingehen („Click"-Reaktionen) [12].

Markierungstechniken
Proteine enthalten meist mehrere Kopien von jeder der 20 natürlichen Aminosäuren (AAs), sodass ein Ankoppeln der Succinimide oder Maleimide an Lysine bzw. Cysteine in den meisten Fällen nicht anwendbar ist (Abb. 1).

Es wurden Strategien zur Markierung der N-terminalen Aminogruppe entwickelt, wie z. B. Transaminierung unter Verwendung von Pyridoxalphosphat und anschließende Oxim-Ligation [13], oder Modifizierung endständiger Serine [14]. In vielen Fällen kommt es jedoch zu post-translationalen Modifikationen des N-Terminus E. coli-exprimierter Proteine zu einem nicht-reaktiven N-Terminus.

Enzym-, Intein- und Metallkomplexbildungs-Tags
Wir teilen enzymatische Reaktionen in zwei Typen ein: In einer Dreikomponentenreaktion (Abb. 2) wird ein wenige Aminosäuren umfassender Tag mit dem Protein fusioniert (Komponente 1). Dieser Tag fungiert als Substrat für ein Enzym (Komponente 2), welches den Tag in eine einzigartige Funktionalität umwandelt, die dann mit dem Farbstoff-Derivat reagiert (Komponente 3). In einem Zweikomponentensystem (Abb. 2) ist das Hilfsenzym selbst der Tag (SNAP / CLIP [15, 16], Halo [17] und TMP-Tag [18]), der jedoch oft groß ist.

Tetracystein-Motive können biarsenische Liganden binden [19] und das multiple His-Tag kann zur Komplexbildung von metallgebundenen Farbstoffen verwendet werden [20]. Ein großer Vorzug dieser Systeme besteht darin, dass der Tag klein ist (ca. 6 Aminosäuren). Aber nur wenige Farbstoffe sind mit diesen Methoden kompatibel. Auch kann die Bindung von Metallkomplexen einen Einfluss auf die photophysikalischen Eigenschaften der Farbstoffe haben, was präzise Einzelmolekülmessungen erschweren kann [21].

Als Beispiel für ein Dreikomponenten-Tag wurde eine Methode entwickelt, die ortsspezifische Aldehyde in Proteine einschleust [22]. Hydrazid- und Hydroxylamin-Farbstoffderivative können Oxim-Ligationen mit Ketonen oder Aldehyden eingehen, was für die Proteinmarkierung genutzt werden kann [23].

Die chemische Ligation ist eine der am weitesten verbreiteten Methoden [24]. Das zu untersuchende Protein ist z.B. mit einem C-terminalen Intein fusioniert, welches nach erfolgreichem Schnitt einen Thioester am C-Terminus hinterlässt. Das Thioester ist gegenüber N-terminalen Cysteinen hochreaktiv. Leider sind Einzelmolekülfarbstoffe, die direkt mit Thioestern regieren, nicht ohne Weiteres verfügbar (Abb. 1). Daher muss ein weiterer Zwischenschritt, wie die Umsetzung des Thioesters mittels Aminolyse [25] oder das Vormarkieren eines kurzen Peptids mit einem N-terminalen Cystein, eingeführt werden.

Unnatürliche Aminosäuren mit spezifischen Reaktivitäten
Die vielseitigste Strategie zur genetischen Kodierung neuartiger bioorthogonaler Reaktivität ist die genetische Kodierung einer nicht kanonischen, unnatürlichen Aminosäure (ncAA). Das Konstruktionsprinzip einer ncAA besteht darin, dass sie eine maßgeschneiderte Funktionalität trägt und einer kanonischen Aminosäure ähnlich genug ist, damit sie die natürliche Translationsmaschinerie nutzen kann. Zwei Strategien wurden entwickelt: Zum einen können ncAAs durch Ausnutzung der Promiskuität natürlicher Synthetasen kodiert werden. Da ncAAs proteomweit eingebaut werden, hat diese Methode wesentliche Auswirkungen auf Proteomikstudien [26]. Eine andere Möglichkeit ist, die genetische Kodierung durch selektive Codon-Suppression, die nur eine oder sehr wenige ncAAs gleichzeitig ortsspezifisch kodiert [27, 28]. Der wesentliche Durchbruch bei dieser Technik war die
Umprogrammierung eines natürlich auftretenden Stop-Codons. Da das TAG-Codon bei E. coli selten vorkommt, funktioniert die Methode durch die Umprogrammierung einer tRNA zum Erkennen dieses Codons. Die Herausforderung besteht darin, dass eine entsprechende Synthetase entwickelt werden muss, die kein natürlich vorkommendes Substrat erkennt. Mehr als 100 ncAAs sind kodiert worden [29], wobei diverse Funktionalitäten angeboten werden, darunter für Oxim-Ligation geeignete Ketone sowie Alkine und Azide für Click-Reaktionen (Abb. 1).

Oxim-Ligation mit genetisch kodierten Ketonen ist eine bioorthogonale chemische Reaktion, die eine quantitative Markierung für die Einzelmolekülwissenschaft erzielen kann [30-33]. Die Reaktion verläuft relativ langsam und hat ihr Optimum im sauren Milieu [11]. Click-Chemie zwischen einem Azid und einem aliphatischen Alkin ist eine weit verbreitete chemische Reaktion, die unter physiologischen Bedingungen rasch abläuft [12]. Diese Reaktion ist für die Einzelmolekülwissenschaft geeignet [33]. Der Bedarf an Kupfer als Katalysator beeinträchtigt aber die Biokompatibilität. Der Einsatz sterisch unter Spannung stehender Alkine hebt die Notwendigkeit eines Katalysators auf und ist daher für voll biokompatibles Markieren von empfindlichen Proteinen und im Zellinneren geeignet [34, 35]. Sowohl Azide als auch Cyclooctine können genetisch kodiert werden, aber da Azide zu Reduktion neigen und bei Langzeit-Expression instabil sind, ist es ratsam, das gespannte Alkin genetisch zu kodieren [36, 37]. Da die Azid-Gruppe Fluoreszenz löschen kann, kann die Reaktion auch fluorogen gestaltet werden, da nicht reagierter Farbstoff nicht-fluoreszent bleiben würde.

Proteinpräzisionstuning in Zellen
Bei vielen der oben erwähnten Methoden wird die bioorthogonale Funktionalität während der Proteinherstellung direkt kodiert und kann somit auch auf extrazelluläre Domänen von Membranproteinen angewandt werden. Markierungen in der Zelle durch semi-synthetischen Methoden setzt voraus, dass der Farbstoff ins Innere der Zelle gebracht werden kann. Wichtig für die Einzelmolekülwissenschaft ist, dass unreagierter Farbstoff fluorogen oder leicht auswaschbar ist. In der Regel kann dies durch Ladungen, wie z. B. durch Sulfonylgruppen erzielt werden. Farbstoffe, die die Membran nicht passieren können, können durch Mikroinjektion, Glasritzexperimente oder die Verwendung von Trägermolekülen ins Zellinnere gebracht werden.

Ein hydrophober Farbstoff, der Membranen leicht passieren kann, wird wahrscheinlich auch an sie binden. Auch hier können fluorogene Reaktionen ein Ausweg sein. An den Fluorophor gebundene Benzylguanin-Gruppen, wie sie in der SNAP/CLIP Technik verwendet werden [15,16], löschen („Quenching") die Fluoreszenz vor dem Markieren [15]. Das „Löschen" bezieht sich jedoch meist nur auf eine etwa 10fache Reduzierung der Helligkeit. Eine Alternative besteht darin, mit äußerst schnellen und spezifischen Reaktionen zu arbeiten, sodass niedrige Konzentrationen an freiem Farbstoff ausreichen. Hier rückt die unter Abbau von Ringspannung erfolgende Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (SPIEDAC, Abb. 1) in den Fokus [38]. Trans-Cyclooctene unterliegen einer extrem schnellen, fast augenblicklichen Reaktionskinetik mit Tetrazinen. Die Kodierung solcher Funktionalitäten ist durch die Verwendung der Liponsäurestrategie [39] sowie durch genetische Kodierung einer geeigneten ncAA [37, 40] gelungen. Während das Tetrazin selbst der Reaktion Fluorogenität verleiht, bietet SPIEDAC zudem alle gewünschten Merkmale.

Einzelmolekülwissenschaften mit Nanoauflösung
Eine geeignete Reporterstrategie vorausgesetzt, kann Fluoreszenz auf vielfältige Art eingesetzt werden, um molekulare Plastizität auf verschiedenen Ebenen zu prüfen.

Räumliche Ergebnisse durch Nanoskopie
Die Grundlage aller superauflösenden Methoden besteht darin, dass Auflösungsmaßstäbe mit dem Signal-Rausch-Verhältnis korrelieren, sodass Methoden mit dünnen optischen Schnitten stark nachgefragt sind. Diese umfassen konfokale oder zwei-Photonen-Scanning-Techniken [41], totale interne Reflektionsfluoreszenz [42] und Lichtschichtmikroskopie [43].

Superauflösungstechniken ohne Software-Nachbearbeitung
Die STED-Mikroskopie (Stimulated emission depletion) ist eine primär Punkt-scannende-Technik, die Einzelphotonzähler mit hervorragenden Signal-Rausch-Eigenschaften verwendet [6]. Während der Grundmodus der Bilderzeugung einem Konfokalmikroskop ähnelt, sind für STED zwei Laserstrahlen erforderlich: ein Anregungsstrahl und ein weiterer, Donut-förmiger Strahl, dessen Wellenlänge so ausgewählt wird, dass sie der Energiedifferenz zwischen dem niedrigeren Schwingungsniveau des Anregungszustands S1 und einem der oberen Schwingungsniveaus des elektronischen Grundzustands S0 entspricht. Dieses Licht ist in der Lage, bereits angeregte Moleküle um den Fokuspunkt in den Grundzustand S0 zurück zu versetzen. Oberhalb einer für das Fluorophor spezifischen kritischen Intensität ist die Intensität des STED-Strahls entscheidend für die erreichbare räumliche Auflösung [44]. Was die zeitliche Auflösung betrifft, so kann Videogeschwindigkeit erzielt werden. Mehrfachstrahl-Scanning-Techniken können noch schneller Bilder aufnehmen [45, 46]. Varianten der STED-Mikroskopie werden unter dem Begriff RESOLFT-Mikroskopie (reversible saturable optical flurorescence transition) [6, 44, 47] zusammengefasst. Analog zur STED beruhen diese Systeme darauf, Farbstoffe vorübergehend in einen metastabilen dunklen Zustand (Triplett) zu versetzen oder auf anderen bistabilen Fluorophorsystemen (wie cis-trans-Isomerisation) [47]. Kleinmolekülfarbstoffe, die bislang mit STED genutzt wurden, umfassen z. B. Atto425, Atto532, Atto647N, Alexa488 und Alexa594 (Abb. 3) [48-51].

Superauflösungstechniken mit Softwarenachbearbeitung
Photophysikalische Eigenschaften, die denen einiger RESOLFT-Methoden ähnlich sind, werden auch in diversen lokalisations-basierten Mikroskopietechniken eingesetzt. Photoschaltbare oder photo-
aktivierbare Fluorophoren werden
zum Beispiel bei der (Fluoreszenz-) Photoaktivierungslokalisationsmikroskopie (PALM/FPALM) eingesetzt. Die Intensität und die Beleuchtungsdauer eines Lasers wird so gewählt, dass nur wenige photoaktivierbare AFPs in einer Probe aktiviert sind. Im Durchschnitt sind diese mit ausreichend Abstand angeordnet, sodass jedes Molekül als einzelner Fluoreszenzpunkt sichtbar ist. Durch Lokalisierung des Zentrums einer Gauß-Verteilung, die diese Fluoreszenzpunkte beschreibt,
können die Fluorophore mit einer Genauigkeit von z.T. unter 25 nm lokalisiert werden. Iterative Aktivierungs- und Bleich-Zyklen sowie Softwarenachbearbeitung zum Überlagern der gesamten Positionsinformationen erzeugen ein superauflösendes Bild [7, 8].

Im Gegensatz zu PALM verwendet die STORM-Mikroskopie (stochastic optical reconstruction microscopy) synthetische Farbstoffe für das Photoswitching [9, 52]. Bei dieser Methode werden verschiedene Cyaninfarbstoffe in eine klar definierte, unmittelbare Nähe gebracht. Die Aktivierungs- und Emissionswellenlängen der Sonden sind entsprechend der verwendeten Farbstoffkombination (Cy3 / Cy5, Cy3 / Cy7, Cy2 / Cy5 usw.) angepasst. Für ein Cy3 / C5-Paar werden sättigenden Intensitäten eines roten Lasers dazu verwendet, die roten Farbstoffe (Cy5) in den dunklen Zustand zu bringen. Nach Anregung von Cy3 mit einem grünen Laser wird der rote Farbstoff stochastisch reaktiviert und fluoresziert [9, 52]. Diese Idee rührt ursprünglich von der Beobachtung her, dass Cy3 und Cy5 ein distanzabhängiges Photoschaltverhalten an den Tag legen, dass weder auf FRET noch auf Elektronentransfer beruht [53]. Tatsächlich bringt in vielen Fällen die Beleuchtung mit einem roten Laser die roten Fluorophoren in ihren dunklen Zustand, während ein grüner Laser die Farbstoffe wieder in ihren fluoreszierenden Zustand zurückversetzt. In Abwesenheit eines Aktivatorfluorophors muss die Intensität des grünen Lasers jedoch um das 200-fache erhöht werden. Stochastische Einzelmolekül-Lokalisierung blinkender Cyaninfarbstoffe ohne einen Aktivatorfarbstoff wurde daher als direkte STORM- (dSTORM) [54] und / oder Ground-State Depletion Imaging-Mikroskopie (GSDIM) bezeichnet [55]. Für den Photoswitching-Mechanismus z. B. von Cyaninfarbstoffen, bilden Thiole stabile und dunkle Addukte mit den Farbstoffen, was ebenfalls ein Grund dafür ist, warum stochastisches Umschalten von Cyaninfarbstoffen bei STORM und dSTORM spezielle Blinkpuffer benötigen [56, 57]. Molekularer Sauerstoff ist dafür bekannt, Triplet-Zustände zu löschen, kann aber auch radikalische Ionen wie diejenigen, die in dunklen Zuständen entstehen, löschen. Blinkpuffer beinhalten daher häufig ein Sauerstoff-Auffangsystem, um die Reaktivierung der fluoreszierenden Probe besser kontrollieren zu können [54,58]. Die Notwendigkeit, den Farbstoff in Blinkpuffer einzubetten, begrenzten solche Experimente zunächst ausschließlich auf fixierte Proben oder extrazelluläre Untersuchungen. Farbstoffe, die für dSTORM und GSDIM verwendet wurden, sind z. B. Alexa488, Alexa532, Atto565 und Alexa647 [55, 57, 59, 60]. Aufgrund der hohen zellulären Glutathionkonzentrationen wurde nahegelegt, dass die Blinkmikroskopie und somit dSTORM/GSDIM im Prinzip auch in lebenden Zellen verwendet werden können [61]. Tatsächlich wurden solche Techniken bereits in lebenden Zellen mit Fluorophoren eingesetzt, die intrinsisch blinken, und auch mit synthetischen Farbstoffen wie Atto532 oder Oregon Green sowohl in Anwesenheit [55] als auch in Abwesenheit eines Sauerstoff-Auffangsystems [62].

Diverse Methoden wurden entwickelt, um die Aufnahmegeschwindigkeit von lokalisations-basierter Mikroskopie zu erhöhen. Eine Möglichkeit ist die Erhöhung der Laserstärke des roten Lasers, der die fluoreszenten Proben inaktiviert hatte. Durch Dauerbeleuchtung (Continuous wave imaging) mit dem roten Inaktivierungs- und Imaging-Laser und einem 405-nm Reaktivierungslaser gelang die Aufnahme eines superauflösenden Bildes in nur wenigen Sekunden [63].

Konformationsmessungen mit Fluoreszenz
Alle bisher vorgestellten Techniken beruhen auf der Bestimmung der räumlichen Lokalisierung von fluoreszierenden Sonden. Im Gegensatz dazu bestimmen andere hochauflösende Methoden nicht die exakte Lokalisierung einer Sonde, sondern messen stattdessen den Abstand zwischen zwei Sonden. Zu diesen Methoden gehören der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) [64, 65], Fluoreszenzlöschen [66], Elektronentransfer [67, 68] und distanzabhängige Wechselwirkungen zwischen Cy3 und Cy5, dem STORM zugrundeliegenden Prinzip [9, 52, 53], wie oben beschrieben.

FRET als molekulares Lineal
Eine Gemeinsamkeit dieser Methoden ist ihre Abhängigkeit von positonsspezifischer Markierung mit synthetischen Fluorophoren: Mittels strahlungsfreier Energieübertragung durch Dipol-Dipol-Wechselwirkungen misst FRET die Abstände zwischen einem Donor- und einem Akzeptor-Fluorophor im Bereich von 3 - 10 nm. Die Anforderungen an die auf Einzelmolekülebene eingesetzten FRET-Sonden sind Helligkeit, Photostabilität und die Bildung eines FRET-Paars zwischen den zwei Sonden. Für die FRET-Paarbildung ist es notwendig, dass das Emissionsspektrum des Energiedonors eine ausreichende Überlappung mit dem Anregungsspektrum des Akzeptors aufweist. Tatsächlich erfolgt mit der Auswahl des Farbstoffpaars auch eine Auswahl des sensitiven Messbereichs abhängig vom Grad des spektralen Überlapps zwischen den beiden Fluorophoren [69]. Cy3 / Cy5 ist ein häufig eingesetztes FRET-Paar [70-72], ebenso Alexa488/Alexa594 [32, 33, 73, 74]. Orangefarbene Farbstoffe wie Alexa 555 [75], TAMRA und einige Varianten von Atto werden ebenfalls vielfach verwendet. Rote Farbstoffe wie Atto647N und Alexa647 sind beliebte Alternativen zu Cy5 [31, 69]. FRET-Bestimmungsversuche beruhten zunächst auf Fluoreszenzintensitäten, es wurde aber deutlich, dass diese Methode unter vielen Artefakten leidet. Eingeschränkte Rotationsfreiheit kann beispielsweise FRET beeinflussen [64, 76], und die Entfernungsbestimmung reagiert höchst empfindlich auf Hintergrundfluoreszenz, Kreuz-Kontamination zwischen den verschiedenen Farbkanälen und andere Fluoreszenz-Löschungsmechanismen. Aus diesen Gründen wird FRET hauptsächlich zum Nachweis relativer Abstandsänderungen eingesetzt. Multiparametermessungen, die Fluoreszenzani-
sotropie, -intensität und -lebensdauer analysieren, sind jedoch effektiv, um verlässliche Entfernungsanzeigen zu liefern [32, 33, 77, 78]. Dementsprechend sind Farbstoffe mit längerer Lebensdauer besser für Einzelmolekülstudien geeignet. Leider haben viele rote Farbstoffe nur eine recht kurze Lebensdauer [79]. Außerdem wurden Mehrfarben-Anwendungen entwickelt, die immer häufiger eingesetzt werden. Diese Anwendungen funktionieren bislang nur mit Intensitäts-basiertem FRET. Aufgrund ihrer Komplexität werden sie hauptsächlich dazu verwendet, relative Distanzveränderungen zu messen [80 - 84]. Um das Markieren mit verschiedenen Farben und deren schwierige Detektion zu vermeiden, wurde eine Multiakzeptor-Markierungsstrategie entwickelt, die auf reversiblem Ein- und
Aussschalten (Photoswitching) des Akzeptorfarbstoffs beruht, ähnlich wie bei dSTORM, sodass zu jedem Zeitpunkt nur eine Distanz ausgelesen wird [72].

Fluoreszenzlöschung als Entfernungsmaß
Die Stärke des FRET-Effekts ist umgekehrt proportional zur sechsten Potenz der Entfernung zwischen den Fluorophoren. Im Gegensatz dazu ist Fluoreszenzlöschung exponentiell abhängig von der Entfernung zwischen Fluorophor und Quencher. Drei Hauptlöschmechanismen sind beschrieben worden: Ein Mechanismus induziert ein „Intersystem Crossing" des angeregten Fluorophoren durch schwere Atome oder molekularen Sauerstoff, und die nachfolgende strahlungslose Rückkehr vom Triplett-Zustand. Der zweite Mechanismus beruht auf Elektronentransfer zwischen dem angeregten Donor-Molekül und einem Akzeptor, auch bekannt als Dexter-Transfer. Der dritte Mechanismus wird photoinduzierter Elektronentransfer (PET) genannt. Er basiert ebenfalls auf dem Elektronenaustausch zwischen einem Donor und einem Akzeptor. Im Unterschied zum Dexter-Transfer kann die Richtung des Elektronentransfers durch das Redox-Potential der zwei Komponenten vorhergesagt werden. Diese Art des Elektronentransfers beinhaltet die Entstehung eines gemeinsamen angeregten Zustands zwischen Donor und Akzeptor - die Bildung eines Exciplexes - die in den meisten Fällen von einer strahlungslosen Rückkehr in ihren Grundzustand begleitet wird. Für viele der Löschprozesse, die in Fluoreszenzkonformationsstudien verwendet werden, ist nicht bekannt, auf welche Art der Löschung sie reagieren, da sie alle derselben Distanzabhängigkeit unterliegen. PET wird auch in der Einzelmolekülfluoreszenz eingesetzt, insbesondere zur Erkennung konformationaler Fluktuationen [67, 68, 86, 87]. Wie bereits erwähnt, und vorausgesetzt die richtigen Kalibriermessungen wurden ausgeführt, kann das für STORM eingeführte Cy3 / Cy5-Paar auch für Kurzstreckenmessungen verwendet werden [52, 53].

Schlussfolgerung
Proteine sind hochdynamische Moleküle und die Beobachtung von Proteinen in Zeit und Raum ist ein schwieriges Unterfangen, das nicht durch eine einzige Technik allein realisiert werden kann. Bislang gibt es noch keine Methode, die die genaue Konformation eines Proteins mit räumlicher Präzision in einer einzelnen lebenden Zelle beobachten kann. Es sind weitere Entwicklungen notwendig, um diese Methode in ein zuverlässiges Instrument der Zellbiologie zu verwandeln. Zur Mehrfarben-Markierung muss mehr als ein Farbstoff kodiert werden. Es ist ermutigend, dass sich das Fachgebiet zumindest bei E. coli rasch in diese Richtung bewegt [88-90].

Hinsichtlich hochauflösender Mikro- skopie sollte beachtet werden, dass die meisten genauen Kurzstreckenmessungen bisher nur in vitro durchgeführt wurden. Proteinkonformationsstudien erfordern die Gewissheit, dass beide visualisierten Fluorophoren an dasselbe Molekül gebunden sind. Außerdem haben nur wenige Farbstoffe ihre Tauglichkeit für Konformationsstudien bewiesen. Sobald Markierungstechniken existieren, die auf nichtinvasive Art jeden spezifischen Proteinbindungsort in der lebenden Zelle markieren
können, werden Multiparameter-Ausrüstungen benötigt, die ein verlässliches Messergebnis mit räumlicher und zeitlicher Präzision in Superauflösung liefern können (Fig. 4).

Danksagung
Wir danken Frau Dr. VanDelinder für ihr kritisches Korrekturlesen des Manuskripts und allen Mitgliedern der Lemke-Gruppe für ergebnisreiche Diskussionen. Sigrid Milles bedankt sich für die Unterstützung seitens des Boehringer Ingelheim Fonds und Edward Lemke für Unterstützung durch das Emmy Noether-Programm sowie das Schwerpunktprogramms 1623 der Deutschen Forschungsgemeinschaft.

Die Literatur ist bei der Redaktion erhältlich

 

Autor(en)

Kontaktieren

EMBL
Meyerhofstr. 1
69012 Heidelberg
Germany
Telefon: +49 6221 387 317
Telefax: +49 6221 387 518

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.