Neue Wege in der Krebsdiagnostik

Mikrofluidische Strategien für die Medizin 4.0

  • Abb. 1: LabDisk-Plattform bestehend aus Modul I (Makro) und II (Mikro) für die entsprechenden Prozessschritte: Die Blutprobe wird in die Einlasskammer (A) und DGM (Dichtegradientenmedium) in die Einlasskammer (B) gefüllt. In der Separationskammer (C) werden sowohl überschüssiges Plasma als auch die Erythrozyten vom Buffy Coat abgetrennt, welcher anschließend in die Mischkammer (D) transferiert wird. Hier binden die Zielzellen an die vorgelagerten Magnetpartikel. Ungebundene Zellen sowie Waschpuffer werden in der Abfallkammer (E) verworfen. Weitere Kammern dienen dem Zwischenspeichern und dem Transport der jeweiligen Flüssigkeiten.Abb. 1: LabDisk-Plattform bestehend aus Modul I (Makro) und II (Mikro) für die entsprechenden Prozessschritte: Die Blutprobe wird in die Einlasskammer (A) und DGM (Dichtegradientenmedium) in die Einlasskammer (B) gefüllt. In der Separationskammer (C) werden sowohl überschüssiges Plasma als auch die Erythrozyten vom Buffy Coat abgetrennt, welcher anschließend in die Mischkammer (D) transferiert wird. Hier binden die Zielzellen an die vorgelagerten Magnetpartikel. Ungebundene Zellen sowie Waschpuffer werden in der Abfallkammer (E) verworfen. Weitere Kammern dienen dem Zwischenspeichern und dem Transport der jeweiligen Flüssigkeiten.
  • Abb. 1: LabDisk-Plattform bestehend aus Modul I (Makro) und II (Mikro) für die entsprechenden Prozessschritte: Die Blutprobe wird in die Einlasskammer (A) und DGM (Dichtegradientenmedium) in die Einlasskammer (B) gefüllt. In der Separationskammer (C) werden sowohl überschüssiges Plasma als auch die Erythrozyten vom Buffy Coat abgetrennt, welcher anschließend in die Mischkammer (D) transferiert wird. Hier binden die Zielzellen an die vorgelagerten Magnetpartikel. Ungebundene Zellen sowie Waschpuffer werden in der Abfallkammer (E) verworfen. Weitere Kammern dienen dem Zwischenspeichern und dem Transport der jeweiligen Flüssigkeiten.
  • Abb. 1: LabDisk-Plattform bestehend aus Modul I (Makro) und II (Mikro) für die entsprechenden Prozessschritte: Die Blutprobe wird in die Einlasskammer (A) und DGM (Dichtegradientenmedium) in die Einlasskammer (B) gefüllt. In der Separationskammer (C) werden sowohl überschüssiges Plasma als auch die Erythrozyten vom Buffy Coat abgetrennt, welcher anschließend in die Mischkammer (D) transferiert wird. Hier binden die Zielzellen an die vorgelagerten Magnetpartikel. Ungebundene Zellen sowie Waschpuffer werden in der Abfallkammer (E) verworfen. Weitere Kammern dienen dem Zwischenspeichern und dem Transport der jeweiligen Flüssigkeiten.
  • Abb. 2: Chip-basierter Zellseparator. Rechts: Schematische Darstellung des Ablaufs der Separation: Die Blutprobe (rot) wird durch den Eingang (B) in den Chip gepumpt. Die Zielzell-Magnetbead-Komplexe (schwarze Punkte) werden infolge des applizierten Magnetfelds in die Pufferphase (blau) überführt und in D gesammelt. Links: Magnetscheibe (E), angeordnet unterhalb der Mikrokanäle des Glas-Silizium-Chips (Darstellung ohne Magnetscheibe oberhalb des Chips).

Mikrofluidische Module bilden in der Krebsdiagnostik einen immer wichtigeren Baustein. Eine Anwendung stellt die so genannte Liquid Biopsy dar, bei der aus Blut von Patientenproben seltene Tumorzellen isoliert und charakterisiert werden können. Dieses Prinzip haben sich zwei Institute aus Freiburg und Heilbad Heiligenstadt zunutze gemacht, um ein innovatives Konzept mikrofluidischer Plattformen zu entwickeln, welches eine neue Generation leistungsfähigerer Systeme zur Zelldiagnostik ermöglicht.

Eine der am häufigsten zum Tode führenden Krankheiten weltweit ist der Krebs. Dies belegen Zahlen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) nach denen im Jahr 2015 weltweit 8,8 Millionen Todesfälle registriert wurden. Geschätzt wird ein Anstieg der Krebserkrankungen auf bis zu 25 Millionen innerhalb der nächsten 20 Jahre [1,2]. Deutschlandweit hat sich laut Studien des Robert-Koch-Instituts die Zahl der Neuerkrankungen seit 1970 auf 478000 im Jahr 2013 fast verdoppelt [3]. Zwar konnten Früherkennungsmaßnahmen ein Teil spezieller Krebserkrankungen, wie z. B. Darmkrebs zurückdrängen, insgesamt kann man aber nicht von einer Trendwende sprechen. Für einige besonders gefährliche Tumorarten wie z. B. Bauchspeicheldrüsen- und Leberkrebs muss weiterhin eher von steigenden Zahlen ausgegangen werden. Um eine schnelle und effektivere Behandlung von Tumorerkrankungen zu erzielen, ist die Untersuchung von genetischen Veränderungen im zellulären bis subzellulären Bereich von entscheidender Bedeutung. Hier bietet die Mikrofluidik aufgrund des miniaturisierten Designs die Möglichkeit, einfache, günstige und schnelle Messungen krankheitsbedingter Veränderungen spezifischer Zellen in komplexen biologischen Flüssigkeiten (z. B. im Blut) durchzuführen [4].

Microfluidics meets Diagnostics
Mikrofluidische Plattformen spielen eine immer wichtigere Rolle als diagnostisch relevantes Werkzeug in der Medizin, insbesondere für die Analyse einzelner Zellen. Die Anwendungen reichen dabei von Phänotypisierung durch die Untersuchung biomechanischer Eigenschaften klinisch relevanter Zellsorten, Zellwanderungsstudien durch Gradientenbildung zur Charakterisierung und besseren Verständnisses bei der Metastasenbildung, das Verhalten von Ko-Kulturen und Tumor-Stroma Interaktionen zur Entschlüsselung der Zell-Zell-Kommunikation bis hin zu Einzelzell-Cytomics und Omics [5].

Im Allgemeinen werden für die notwendige Genotypisierung von soliden Tumoren bis dato Gewebebiopsien herangezogen. Die Entnahmen sind jedoch für den Patienten belastend und mit Risiken verbunden, weshalb sie bei Weitem nicht so häufig durchgeführt werden wie erforderlich. Eine erst seit wenigen Jahren angewendete Alternative bilden die Untersuchungen zirkulierender Tumorzellen (CTC) und zirkulierender zellfreier Tumor-DNA (ctDNA) aus Patientenblut [6]. Die Separation bzw. Isolation seltener Krebszellen im Blut (wie z. B. CTC) spielt eine Schlüsselrolle für die personalisierte Medizin, um relevante Informationen über das Stadium der Krebserkrankung zu erhalten und eine zielgerichtete Therapie zu ermöglichen. Bekannte mikrofluidische Methoden zur Separation zirkulierender Tumorzellen beruhen auf biologischen (Oberflächenproteinmarker-Expression) und biophysikalischen Eigenschaften (z. B. Größe, Deformierbarkeit, Dichte, dielektrische und elektrische Eigenschaften) der Zielzellen. Die am häufigsten verwendeten mikrofluidischen Plattformen bedienen sich immunoaffinitäts- oder immunomagnetischer Prinzipien, welche die spezifischen Charakteristika der Oberflächenmarker auf den Zielzellen nutzen. Der limitierende Schritt ist die Bindung der Zielzellen an die mit Antikörpern funktionalisierte Chip- oder Substratoberfläche. Eine wichtige Rolle spielt die Heterogenität der Markerexpression, da nicht alle gesuchten Zielzellen die erwarteten Marker besitzen. Außerdem kann das Ereignis des Aufeinandertreffens zwischen Zielzelle und des mit Antikörpern beschichteten Substrats (z. B. magnetische Partikel) für eine mögliche geringe Sensitivität und lange Prozesszeit des Systems verantwortlich sein. Alternativ hierzu wurden daher u. a. Methoden etabliert, welche die Größenunterschiede der Zellen in der entsprechenden Matrix ausnutzen, um mittels spezieller mikrofluidischer Designs die hydrodynamischen Trägheitskräfte (DLD: Deterministic lateral Displacement) kombiniert mit den dielektrischen Eigenschaften (DE: Dielektrophorese) der Partikel zur Trennung der gewünschten Zellpopulation zu nutzen. Ein weiterer Ansatz, um die Separation ohne eine Zellbehandlung durchzuführen, sind mechanische Filtrationsprinzipien. Trotz der teilweise hohen Flussraten bis zu 25 mL / h haben sich diese Systeme aufgrund der teilweise wenig praktikablen Handhabung der Module, der steigenden Abnahme der Reinheit der Zielzellen und der entsprechenden Ausbeuten bei höheren Durchsätzen sowie der ungenügenden Automatisierbarkeit nicht entscheidend am Markt etablieren können. Die kommerziell auf dem Markt befindlichen Systeme benötigen im Gegensatz zu mikrofluidischen Modulen deutlich mehr magnetische Partikel, um die Bindeeffizienz mit den entsprechenden Zielzellen zu gewährleisten. Des Weiteren sind die portablen Geräte keine geschlossenen Systeme und dadurch anfälliger für Kontaminationen aus der Umgebung. Außerdem erfolgt die Handhabung rein manuell.

Proof of concept mit neu entwickeltem Labdisk-Separationsmodul
Eine große Herausforderung bisher ist es jedoch, die oft sehr wenigen klinisch relevanten Einzelzellen aus einer besonders großen Probenmenge, z. B. 5 – 10 mL Blut, zur Analyse zu separieren. Eine mögliche Lösung besteht in der Realisierung neuartiger „Makro-Mikro-Schnittstellen“, um die Zellen aus einem größeren Probenvolumen (Makro) in ein Kleineres (Mikro) zu überführen. Ein erster, von Hahn-Schickard demonstrierter Separationsansatz basiert auf der zentrifugal-mikrofluidischen Labdisk und zeigt die Separation von 104 Zellen aus 2 ml Vollblut und deren Aufkonzentrierung in 500 µl Zellsuspension (mit dem Potenzial weiterer Volumenreduktion) (Abb. 1). Er besticht durch die Integration der Separation der relevanten Zellen aus Vollblut inklusive anschließender Positivselektion der Zielzellen. Die hierzu notwendigen Prozessketten bestehend aus Einheitsoperationen wurden in zwei monolitisch integrierten Modulen realisiert. In einem ersten Makro-Modul I wird das Plasma von der restlichen Vollblutphase abgetrennt. Anschließend erfolgt die Unterschichtung der Vollblutphase mit einem Dichtegradientenmedium (DGM), so dass am Ende der Dichtegradienten-Zentrifugation in der sogenannten Separationskammer drei Phasen vorliegen, von denen die mittlere, der sogenannte buffy-coat, in dem sich die Zielzellen befinden, in eine „Mikro-Kammer“ befördert wird. Das System ist dafür ausgelegt, die Zellfraktion im klinisch relevanten Bereich des Hämatokritwerts von 25 – 55% zu extrahieren. Die von der Erythrozytenphase abgetrennten Zielzellen werden im darauffolgenden Separationsschritt (Mikro-Modul II) mit den in der Mischkammer vorgelegten Antikörper beschichteten Partikel durch einen speziell hierfür ausgelegten Blasenmischer [7] miteinander gemischt. Während einer sehr kurzen Inkubationszeit von lediglich 10 Minuten binden Antikörper an die entsprechenden Expressionsmarker der Zielzellen. Nach einem mehrmaligen Waschschritt werden die überschüssigen ungebundenen Zellen in die Abfallkammer überführt. Schlussendlich können die gereinigten Zielzellen aus der Disk entnommen und ausgezählt werden, bzw. in weiteren Anwendungen verwendet werden, was z.  B. ein Krebsmonitoring ermöglicht. Alle Prozessschritte erfolgen innerhalb einer Stunde in einer kommerziellen Zentrifuge bei 4°C, um unspezifische Bindungen mit anderen Zellen oder deren Bestandteilen und den Immunpartikeln zu vermeiden. Mit einer Zellfindungsrate von ca. 80% sind die Ergebnisse vielversprechend.


Kontinuierliche Separation mit der Chip-Plattform
Ein zweiter, alternativ verfolgter Ansatz (Abb. 2) des Instituts für Bioprozess- und Analysenmesstechnik besticht durch eine kontinuierliche Zellseparation aus theoretisch beliebig großen Blutvolumina. Eine Limitierung ist lediglich durch die Menge (Kosten) der spezifisch mit Antikörpern beschichteten magnetische Partikel gegeben. Die Separation erfolgt aufgrund der alternierenden Wirkung des von einer speziellen Permanentmagnetanordnung erzeugten inhomogenen Magnetfeldes. Dabei rotieren die Permanentmagneten ober- und unterhalb eines Glas-Silizium-Chips (GeSiM, Großerkmannsdorf) mit integrierten Mikrokanälen, innerhalb derer die Zellseparation durchgeführt wird. Diese wird durch den Übergang der Zielzell-Magnet-Partikel-Komplexe (Zielzellen mit den daran spezifisch gebundenen Magnetpartikeln) aus dem Blut in die Pufferphase erzielt, wobei Blut und Pufferphase parallel als laminare Ströme im Mikrokanal fließen (Abb. 2, linkes Bild). Die Optimierung der Mikrokanalgeometrie sowie des Einflusses des magnetischen Feldes erfolgte mittels Computersimulation. Eine automatisierte Abfolge der Flussraten in den Mikrokanälen gewährleistet den Transport der in die Pufferphase überführten Zielzell-Magnetpartikel-Komplexe sowie der ungebundenen Magnetpartikel in die vorgesehene Kavität D (Abb. 2, rechtes Bild). Die Wiederfindungsraten der unbehandelten Zielzellen aus Puffer lagen bei den Versuchen mit der Chip-Plattform mit ca. 98% im Bereich kommerzieller Systeme. Die Zellseparation mit der Chip-Plattform findet direkt aus Vollblut statt. Trotz dieser für die Zellseparation ungünstigen fluidischen Verhältnisse, hervorgerufen durch die hohe Zelldichte, konnte hier eine Wiederfindungsrate für die Zielzellen aus Vollblut von über 70 % erzielt werden.

Perspektiven und Möglichkeiten
Die aktuellen wissenschaftlichen Kenntnisse im Bereich der Tumor- bzw. Metastasen-Bildung bedürfen weiterer Anstrengungen in der Weiterentwicklung mikrofluidischer Verfahren zur Trennung und Charakterisierung der relevanten Zielzellen [8]. Aufgrund der sehr geringen Anzahl (~5 CTC/7,5 mL) und einer Halbwertszeit von 1-2,4 Stunden im Blut gehört u.a. die schnelle und selektive Anreicherung mit entsprechenden Tumormarkern zu einer der wichtigsten Herausforderungen. Dies beinhaltet auch die Berücksichtigung von mesenchymalen und epithelialen Markern aufgrund des Übergangs von Epithelzellen in Zellen mit mesenchymalen Eigenschaften bei bestimmten Karzinomtypen Epithelial-Mesenchymale Transition (EMT). Neben der Funktionalisierung von Partikeln mit EPCAM (Epithelial cell adhesion molecules) ist daher auch die Beschichtung mit N-Cadherin bzw. Vimentin notwendig, um Falsch-Positive Ergebnisse zu vermeiden [9]. Die technische Umsetzung einer benötigten Hochdurchsatz-Plattform beinhaltet ein Numbering-Up durch Parallelisieren der mikrofluidischen Komponenten und die Integration einer sehr selektiven Detektion durch Ermittlung des Geno- bzw. Phänotyps der Zielzellen.

Quo Vadis Zellseparator
Die beiden neuen hier vorgestellten Zellseparationskonzepte bedürfen nach dem erfolgreichen Proof-of-Concept weiterer Optimierung. Der LabDisk Ansatz soll erweitert werden hinsichtlich der verarbeitbaren Volumen und der Vollautomatisierung durch Vorlage der einzelnen Medien bzw. Waschflüssigkeiten, die Chip-Plattform hinsichtlich der Sensitivität und Selektivität. Weitere künftige Arbeiten werden sich auf die Kombination beider Konzepte konzentrieren. Infolgedessen wird ein breites Volumenspektrum (500 µL bis 100 mL) für die spezifische Separation von Zielzellen aus Vollblut zur Verfügung stehen. Die Anwendung wird vor allem den medizinischen bzw. klinischen Markt bedienen.

Danksagung
Gefördert wurde das IGF-Vorhaben durch die Arbeitsgemeinschaft industrieller Forschungsvereinigungen „Otto von Guericke“ e.V. (AiF) unter dem Titel des „Biomagnetische Zellseparation auf Basis der „Lab-On-Disk“ Technologie für die „Point of Care“ Diagnostik – BioCellLab“ (Fördernummer: 18073 BG/1).
 

Autoren
Jörg Schemberg1, Mara Specht2 und Marc Karle2

Zugehörigkeit
1 Institut für Bioprozess- und Analysenmesstechnik e.V., Heilbad-Heiligenstadt, Deutschland
2 Hahn-Schickard-Gesellschaft e.V., Freiburg, Deutschland

Kontakt
Dr. Jörg Schemberg

Fachbereich Bioprozesstechnik 
Institut für Bioprozess- und Analysenmesstechnik e.V.
Heilbad-Heiligenstadt, Deutschland
joerg.schemberg@iba-heiligenstadt.de 

Referenzen
[1] www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/
[2] B. W. Stewart, C. P. Wild (2014) World Cancer Report. International Agency for Research On Cancer
[3] Neue Daten zu Krebs (2015) Pressemitteilung des Robert-Koch-Instituts (www.rki.de)
[4] S. T. Sanjay, G. Fu, M. Dou, F. Xu, R. Liu, H. Qi, X.-J. Li (2015) Biomarker detection for disease diagnosis using cost-effective microfluidic platforms, Analyst, 140, 7062-7081
[5] P. K. Chaudhuri, M. E. Warkiani, T. Jing, K. C. T. Lim (2016) Microfluidics for research and applications in oncology, Analyst, 141 (2), 504-541
[6] C. Alix-Panabière, K. Pantel (2016) Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy, Cancer Discov., 6 (5), 479-491
[7] S. Burger, M. Schulz, F. von Stetten, R. Zengerle, N. Paust (2016) Rigorous buoyancy driven bubble mixing for centrifugal microfluidics, Lab Chip, 261 – 268
[8] K. Pantel, M. R. Speicher (2016) The biology of circulating tumor cells, Oncogene, 35, 1216-1224
[9] C. Alix-Panabière, K. Pantel (2014) Challenges in circulating tumor cell research, Nature Reviews Cancer, 14, 623-631

Mehr Artikel zur Krebsforschung: http://www.git-labor.de/category/tags/krebsforschung

Autor(en)

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Rosenhof
37308 Heilbad Heiligenstadt
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Telefon: +49 3606 671 0
Telefax: +49 3606 671 200

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