Nicht-invasive, Label-freie Analytik lebender, tierischer Zellen

Untersuchung zellulärer Reaktionen mit SPR-Sensoren

  • Abb. 1: Schemazeichnungen zum Aufbau des SPR Ganzzellsensors: Bildteil (A) zeigt die Kretschmann Konfiguration mit deren Hilfe die Anregung von Oberflächenplasmonen an einer Metall/Dielektrikum-Grenzfläche möglich ist. Bildteil (B) gibt die Sensorarchitektur, die auf der Goldoberfläche realisiert wurde, wieder. Ein Phasenkontrast Bild der auf dem Sensor kultivierten Zellen (MDCK-II, 100x) zeigt die typische Morphologie dieser adherent wachsenden Epithelzellart.Abb. 1: Schemazeichnungen zum Aufbau des SPR Ganzzellsensors: Bildteil (A) zeigt die Kretschmann Konfiguration mit deren Hilfe die Anregung von Oberflächenplasmonen an einer Metall/Dielektrikum-Grenzfläche möglich ist. Bildteil (B) gibt die Sensorarchitektur, die auf der Goldoberfläche realisiert wurde, wieder. Ein Phasenkontrast Bild der auf dem Sensor kultivierten Zellen (MDCK-II, 100x) zeigt die typische Morphologie dieser adherent wachsenden Epithelzellart.
  • Abb. 1: Schemazeichnungen zum Aufbau des SPR Ganzzellsensors: Bildteil (A) zeigt die Kretschmann Konfiguration mit deren Hilfe die Anregung von Oberflächenplasmonen an einer Metall/Dielektrikum-Grenzfläche möglich ist. Bildteil (B) gibt die Sensorarchitektur, die auf der Goldoberfläche realisiert wurde, wieder. Ein Phasenkontrast Bild der auf dem Sensor kultivierten Zellen (MDCK-II, 100x) zeigt die typische Morphologie dieser adherent wachsenden Epithelzellart.
  • Abb. 2: Bildteil (A) zeigt eine Auswahl typischer Zeit/Reflektivitäts-Verläufe, die für NRK bw. MDCK-II zellbedeckte SPR-Sensoren im Falle von hypertonen bzw. hypotonen Stimulationen aufgenommen werden konnten. Der Startpunkt der osmotischen Stimulation ist jeweils mit einem schwarzen, der Endpunkt mit einem grauen Pfeil gekennzeichnet. Bildteil (B) zeigt die Anwendung von exponentiellen Modellen (y = R0 - R1 . exp(-x/t) für hypertone und y = R0 + R1 . exp(-x/t) für hypotone Stimulationen), die normalerweise für die Auswertung von (Licht-)mikroskopischen Daten von Zellvolumenänderungen verwendet werden, auf die erhaltenen Daten. Die Zeitkonstanten der zellulären Reaktionen auf osmotischen Stress, die dadurch aus den SPR-Daten extrahiert werden können, entsprechen denen, die für Zellvolumenänderungen und Wasserfluss über die Zellmembran gemessen werden können [15].
  • Abb. 3: Die Nachweisgrenzen des SPR-Ganzzellsensors für hypertone bzw. hypotone Stimulationen konnten durch Auftragungen der gemessenen Reflektivitätsänderungen (DRU) gegen die jeweilige Osmolaritätsänderung im Messpuffer ermittelt werden. Als minimaler DRU Wert, bei dem noch eine verlässliche Detektion einer zellulären Reaktion mittels SPR möglich war, wurde der dreifache Signal/ Rausch-Pegel (12 RU) verwendet
  • Abb. 4: Die große Bedeutung von Veränderungen des (Aktin-)Zytoskeletts im Rahmen zellulärer Reaktionen als SPR-Signalmodulator kann z. B. durch Zugabe von Cytochalasin-D zum Messmedium gezeigt werden. Während eine hypotone Stimulation (DOsm = -125 mOsm/kg) vor der Zugabe von Cytochalasin ein deutliches Signal in der Messung ergibt, kann nach der Zugabe von 5 mM Cytochalasin-D zum Messmedium nur noch eine sehr geringe Signaländerung bei der gleichen hypotonen Stimulationsstärke festgestellt werden.

Der direkte Zusammenhang von Störungen in der Zellvolumenregulation und akuten sowie chronischen Krankheitsbildern bedingt einen dringenden Bedarf der biomedizinischen Diagnostik an Biosensoren, die eine effiziente Analytik des Zellvolumens gestatten. Dabei stehen vor allem solche Sensoren im Vordergrund, die eine zeitaufgelöste Verfolgung der Volumenänderung in lebenden Zellen ermöglichen, ohne die biologischen Vorgänge in der Zelle durch den Einsatz von Markersubstanzen in irgend einer Weise zu beeinflussen (Label-freie, nicht-invasive Sensoren).

Das Zellvolumen als biomedizinisch relevanter Diagnoseparameter

In komplexen eukaryotischen Organismen, z.B. in Säugetieren, wird die extrazelluläre Osmolarität (Anzahl an osmotisch aktiven Teilchen) in den meisten Geweben durch komplexe Mechanismen in einem sehr eng begrenzten Bereich reguliert. Nur sehr wenige Zellen, wie z.B. Epithelzellen der Niere, sind unter physiologischen Bedingungen aufgrund ihrer gewebespezifischen Funktion stärkeren Schwankungen in der Osmolarität ausgesetzt und haben daher die Fähigkeit, sich an diese Änderung anzupassen [1].

Eine durch zelleigene bzw. –fremde Reize veränderte Zusammensetzung der extrazellulären Flüssigkeit in Geweben, deren Zellen solch eine Anpassung nicht ohne weiteres durchführen können, führt häufig zu entsprechenden Änderungen des Zellvolumens und damit zu pathophysiologischen Veränderungen im Organismus. Medizinische Diagnosen, die mit derartigen Veränderungen zusammenhängen, umfassen unter anderem Nieren- bzw. Leberversagen [2], systemische Entzündungsreaktionen (Sepsis) [3] oder die Entstehung von Ödemen nach traumatischen Hirnverletzungen (Schädel-Hirn-Trauma) [4].

Dabei treten, je nach betroffenem Gewebetyp, erste pathogene Auswirkungen bereits ab einer osmotischen Schwankung von weniger als 10 mOsm/kg im Vergleich zum physiologischen Normalzustand auf [5]. Aus dem Zusammenhang zwischen Änderungen des Zellvolumens und chronischen Krankheitsbildern ergibt sich daher ein hoher Bedarf nach Sensoren, die diese Veränderung detektieren können ohne die biologischen Vorgänge selbst zu beeinflussen.

Die Oberflächen Plasmon Resonanz (SPR)

In den letzten 20 Jahren ist auf dem Gebiet der Label-freien optischen Techniken die Messung der SPR als Methode für die Analytik von bimolekularen Wechselwirkungen immer stärker in den Fokus gerückt.

Es handelt sich dabei um eine Biosensortechnologie, bei der die Energie eines Lichtstrahls, der unter einem bestimmten Winkel auf eine Grenzfläche zwischen einem hochbrechenden Prisma und einem Medium mit geringerem Bechungsindex (z.B. wässrige Pufferlösungen) eingestrahlt wird, dazu dient, ein sog. evaneszentes Energiefeld anzuregen.

Dieses Energiefeld reicht dabei nur wenige hundert Nanometer in das gering brechende Medium hinein. Das Elektronengas einer dünnen Edelmetallschicht, die direkt an dieser Grenzfläche zwischen Prisma und Medium aufgebracht wird (Kretschmann Konfiguration, Abb. 1a), kann durch dieses evaneszente Feld zu resonanten Schwingungen (Oberflächenplasmonen) angeregt werden.

Wenn eine derartige Resonanz zwischen Anregungslicht und Oberflächenplasmonen besteht, wird die Energie des Anregungslichtes völlig auf die Plasmonen übertragen und kann daher nicht mehr von der Grenzfläche ins Prisma zurückgestrahlt (reflektiert) werden. Durch die Messung des Anteils an reflektiertem Licht kann auf die Stärke der Resonanz rückgeschlossen werden.Der Einfallwinkel unter dem die SPR angeregt werden kann, ist dabei vom Brechungsindex des Mediums an der Grenzfläche abhängig.

Eine Veränderung der Substanzbelegung an der Edelmetalloberfläche verändert diesen Brechungsindex und führt daher zu einer Verschiebung der Stärke der Reflektivität des eingestrahlten Lichtes. Aufgrund dieses Zusammenhangs wurde in der Vergangenheit eine Vielzahl von Arbeiten veröffentlicht, in deren Rahmen kinetische Konstanten von biologisch relevanten Interaktionen, wie Antikörper/Antigen, Enzym/Substrat, Nukleinsäure/Nukleinsäure etc., mittels SPR analytisch bestimmt werden konnten [6].

Daneben wurden in den letzten Jahren auch zunehmend SPR Sensorkonzepte vorgestellt, bei denen nicht nur Schichten aus einzelnen Biomolekülen, sondern auch komplette, lebende Zellen als Transducer- Elemente eingesetzt werden können [7]. Dabei zielen diese Sensoren nicht auf die Analyse von einzelnen molekularen Vorgängen in den Zellen ab, sondern vielmehr auf die zelluläre Reaktion als eine Summe von einzelnen intrazellulären Vorgängen, die jede für sich den Brechungsindex im evaneszenten Messfeld beeinflussen.

Die Verschiebung des Brechungsindex als integraler Parameter für die Antwort einer Zelle auf innere und äußere Reize kann mittels SPR Sensoren zeitaufgelöst sehr effizient verfolgt werden [8].

Einsatz von SPR-Sensoren

Das oben beschrieben Verfahren der SPR-basierten, zellulären Sensorik wurde in den letzten Jahren am Institut für Analytische Chemie der Uni Regensburg sehr erfolgreich dafür eingesetzt, Zellvolumenänderungen Label-frei, nicht-invasiv und mit hoher zeitlicher Auflösung zu verfolgen. Die wichtigsten Ergebnisse dieses Projektes sollen im Folgenden kurz beschrieben werden: Zunächst werden geeignete Zelltypen, im vorliegenden Fall Epithelzellen aus der Hunde- (MDCK-II) bzw. der Rattenniere (NRK), auf die Goldoberfläche des SPR Sensors aufgebracht.

Die adhärenten Zellen wachsen dabei mit der für sie typischen Morphologie zu dichten (konfluenten) Schichten heran (Abb. 1b). Durch die Ausbildung von Zell/Zell-Kontakten wirken diese konfluenten Zellschichten isolierend für den Durchtritt von Substanzen aus der Bulkphase in den Empfindlichkeitsbereich der SPR nahe der Oberfläche. Entsprechende Experimente zeigen anschaulich, dass Substanzen, die der Bulkphase zugesetzt werden und dort den Brechungsindex deutlich verschieben ohne jedoch eine zelluläre Reaktion zu bedingen, derart von der Sensor-anhaftenden, mehrere Mikrometer dicken Zellschicht zurückgehalten werden, dass sie keinen Einfluss auf das SPR Signal nehmen können.

Die Substanzen gelangen also nicht bis ins evaneszente Messfeld, das nur wenige hundert Nanometer in den unteren Teil der Zellschicht eindringt. Mit anderen Worten, messbare Änderungen im SPR-Signal können demzufolge auf Brechungsindexänderungen im Sensor-nahen Bereich und damit auf Brechungsindex verändernde zelluläre Reaktionen zurückzuführt werden [9].

Um zelluläre Reaktionen der jeweiligen Sensor-anhaftenden Zellsorte auf Osmolaritätsänderungen zu provozieren, wurden nach Einstellung eines konstanten SPR-Signals bei isotoner Osmolarität die Messpuffer mit verschiedenen Konzentrationen an Saccharose beladen. Da die Saccharose von den gemessenen Zellen nicht aufgenommen werden kann, entsteht für diese ein osmotisches Ungleichgewicht, bei dem die Osmolarität extrazellulär höher ist als intrazellulär, ein sog. hypertoner Stresszustand. Analog kann durch den Zusatz von sterilem Wasser das Messmedium verdünnt werden, wodurch eine hypotone Stimulation der Zellschichten resultiert.

SPR-Sensorgramme die während derartiger osmotischer Stimulationen von Zellschichten aufgezeichnet wurden (Abb. 2a), zeigen Zelltyp-abhängige Signalhöhen und -trends. Dass die Signale dabei mit Änderungen des Zellvolumens in den konfluenten Zellschichten korrelieren, kann durch die Anwendung von kinetischen, ursprünglich für die Analyse von (licht-)mikroskopischen Bildern entwickelten Modellen auf die SPR-Daten belegt werden (Abb. 2b). Dabei erhält man ähnliche Zeitkonstanten für die mit der Mikroskopie beobachtete Zellvolumenänderung sowie die mittels SPR gemessenen zellulären Reaktionen wenn die Zellschichten in gleicher Art osmotisch stimuliert werden [10].

Die SPR detektiert dabei jedoch nicht, wie die Mikroskopie, die Zellhöhenänderungen (eine direkte Folge von Zellvolumenänderungen in konfluenten Zellschichten), sondern im evaneszenten Feld ablaufende Brechungsindexänderungen im unteren Teil der Zellschicht. Dabei treten die ersten zellulären Änderungen und dadurch bedingt auch Brechungsindexvariationen deutlich vor der für die Mikroskopie sichtbaren Morphologieänderung der Zellen auf, was ein deutlich schnelleres Ansprechverhalten der SPR-Zellvolumenmessung anzeigt.

Zudem bietet die SPR die Möglichkeit, die zelluläre Antwort auf den osmotischen Stress kontinuierlich online verfolgen zu können, wobei die zeitliche Auflösung bis in den Millisekundenbereich reicht. Durch Mehrfachmessungen von Konzentrationsreihen unterschiedlich stark osmotisch veränderter Pufferlösungen, konnte sowohl für den hypertonen als auch für den hypotonen Bereich die minimale Änderung der Pufferosmolarität ermittelt werden, ab der eine eindeutige zelluläre Reaktion mittels SPR nachgewiesen werden kann (Nachweisgrenze des Sensors, Abb. 3).

In beiden Fällen ergeben sich dabei Werte unter 5 mOsm / kg. Diese Nachweisgrenzen liegen deutlich niedriger als die für medizinisch relevante Fragestellungen benötigten Werte von 30 – 10 mOsm / kg, sodass eine potentielle Anwendbarkeit des SPR-Zellsensorkonzepts für die medizinische Grundlagenforschung in diesem Bereich möglich erscheint.

Die niedrige Nachweisgrenze in Kombination mit der hohen Zeitauflösung wird derzeit von keiner mikroskopischen Messtechnik (derzeitiger Standard bei der Zellvolumen Diagnostik) erreicht. Einzig die auf der Grundlage von Impedanzmessungen basierende Volumen-Zytometrie [11] bietet in Bezug auf die genannten Performance-Werte bei Messungen des Zellvolumens eine Alternative zum vorgestellten Sensorkonzept.

Die Volumen- Zytometrie zeigt jedoch im Vergleich zum SPRZellsensor eine sehr starke Abhängigkeit von Schwankungen der Leitfähigkeit im Messmedium, die im Falle einer potentiellen Anwendung auf medizinisch relevantes Probenmaterial jedoch erwartet werden müssen. Wie oben erwähnt, unterliegt der Sensor keinen derartigen Bulkphasen bzw. Matrixeffekten, solange sie keine zelluläre Reaktion bewirken.

Übertragung des Sensorkonzepts

Neben der reinen Anwendung der Zellsensoren zur Detektion zellulärer Reaktionen steht die Suche nach den zellulären Komponenten im Vordergrund, die letztendlich für die Verschiebung des Brechungsindex und damit für die Modulation des SPR-Signals verantwortlich sind. Eigene Arbeiten sowie Studien anderer Gruppen auf dem Gebiet der SPR-Ganzzellsensorik weisen darauf hin, dass die Verschiebung des Brechungsindex im evaneszenten Messfeld nicht auf einen einzelnen Modulator zurückzuführen ist, sondern vielmehr auf eine Summe aus einzelnen zellulären Reaktionen (Konzentrationsveränderungen von Signalmolekülen [12], Änderung des basolateralen Membranabstands zum Sensor [13], Umstrukturierung des Zytoskeletts [14], etc.), die jeweils einen Teil zur Brechungsindexänderung liefern.

Den größten Anteil an der Signalmodulation scheint dabei die Dynamik des Cytoskeletts (vornehmlich der Umbau der membrannahen Aktinstrukturen) zu haben. Dies wird z.B. aus Messungen ersichtlich, bei denen spezifische Inhibitoren (z.B. Cytochalasin D) eingesetzt werden, die die Restrukturierung des Aktinzytoskeletts unterbinden. Bei Anwesenheit solcher Inhibitoren tritt eine erhebliche Abschwächung des Messsignals für osmotische Stimulationen auf (Abb. 4).

Obwohl endgültige experimentelle Beweise für den prominenten Einfluss der Zytoskelettdynamik auf das SPR-Signal ganzer lebender Zellen noch ausstehen, so kann doch davon ausgegangen werden, dass alle zellulären Reaktionen, die durch unmittelbare oder sekundäre Effekte (z. B. Ca2+ Freisetzung) das Zytoskelett beeinflussen, ein deutlich messbares Signal erzeugen. Unter dieser Prämisse eröffnet sich für die Ganzzellsensoren ein breites Anwendungsfeld in der Analytik von zellulären Vorgängen, die mit einer Morphologieänderung und damit zwangsläufig einer Restrukturierung des Zytoskeletts der beobachteten Zellen einhergehen Medizinisch relevante Felder, wie die Untersuchung des gerichteten Zelltods (Apoptose) oder die Differenzierung von Stammzellen sind nur zwei der zahlreichen Beispiele, in denen das Sensorkonzept Anwendung finden könnte.

Die derzeit etablierten Methoden für die vorgenannten Forschungsfelder, vor allem im medizinisch analytischen Bereich, basieren weitestgehend auf der (Licht)-Mikroskopie. Für eine sichere Diagnostik mit diesen Techniken bedarf es jedoch entsprechend ausgeprägter morphologischer Änderungen, die häufig nur das kummulierte Ergebnis viel früher auftretender zellulärer Vorgänge sind. Hier kann das vorgestellte Label-freie und biokompatible Messkonzept aufgrund seiner hohen Sensitivität gepaart mit der guten Zeitauflösung Abhilfe schaffen.

Literatur

[1] Lang F.: J. Am. Coll. Nutr., 26, S. 613S–623 (2007)

[2] Waldegger S. et.al.: Nephrol. Dial. Transplant. 13, 867–874 (1998)

[3] Oliveira R. P. et.al.: Crit. Care 6, 418–423 (2002) [

4] Francony G. et.al.: Crit. Care Med. 36, 795–800 (2008)

[5] Andrew R. D.: J. Neurol. Sci. 101, 7–18 (1991)

[6] Pattnaik P.: Appl. Biochem. Biotechnol. 126, 79–92 (2005)

[7] Robelek R.: Bioanalytical Reviews 1, 57–74 (2009)

[8] Chabot V. et.al.: Biosens. Bioelectron. 24, 1667–1673 (2009)

[9] Robelek R. und Wegener J.: Biosens. Bioelectron. 25, 1221-1224 (2010)

[10] Baumgarten S. und Robelek R.: Sensors and Actuators B: Chemical 156, 798–804 (2011)

Weitere Literaturstellen können beim Autor erfragt werden.

Autor(en)

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Universität Regensburg- Institut für Analyt. Chemie, Chemo- und Biosensorik
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