Oligodendrozytendifferenzierung im Zebrafisch

In-vitro Analyse primärer OPCs

  • Abb. 1: Gewinnung einer hochreinen und vitalen Population von primären Oligodendrozytenvorläuferzellen (OPCs). (i) Präparation und Entnahme des Rückenmarks. (ii) Gewebeverdau und zelluläre Kernfärbung. (iii) Sortierung der Zellsuspension (FACS). (iv) Die OPC-Suspension kann direkt in verschiedenen Assays verwendet werden: Modified from [3] © 2017 Kroehne, Tsata, Marrone, Froeb, Reinhardt, Gompf, Dahl, Sterneckert and Reimer (CC BY 4.0).Abb. 1: Gewinnung einer hochreinen und vitalen Population von primären Oligodendrozytenvorläuferzellen (OPCs). (i) Präparation und Entnahme des Rückenmarks. (ii) Gewebeverdau und zelluläre Kernfärbung. (iii) Sortierung der Zellsuspension (FACS). (iv) Die OPC-Suspension kann direkt in verschiedenen Assays verwendet werden: Modified from [3] © 2017 Kroehne, Tsata, Marrone, Froeb, Reinhardt, Gompf, Dahl, Sterneckert and Reimer (CC BY 4.0).
  • Abb. 1: Gewinnung einer hochreinen und vitalen Population von primären Oligodendrozytenvorläuferzellen (OPCs). (i) Präparation und Entnahme des Rückenmarks. (ii) Gewebeverdau und zelluläre Kernfärbung. (iii) Sortierung der Zellsuspension (FACS). (iv) Die OPC-Suspension kann direkt in verschiedenen Assays verwendet werden: Modified from [3] © 2017 Kroehne, Tsata, Marrone, Froeb, Reinhardt, Gompf, Dahl, Sterneckert and Reimer (CC BY 4.0).
  • Abb. 2: Strategie zur Aufreinigung von OPCs mit einem Durchflusszytometer (FACS) und anschliessende Transkriptionsanalyse. (A) Dot Plot: gating von OPCs anhand von zwei Fluoreszenzsignalen: zytoplasmatische dsRed-Intensivität (X-Achse) und nukleäre Vybrant DyeCycle Violet- Intensivität (Y-Achse). (B) Dot Plot: gating von OPCs anhand der Intensitäten von GFP (X-Achse) und Vybrant DyeCycle Violet (Y-Achse). (C) Dot Plot: um die Viabilität und Reinheit der aufgereinigten Zellsuspension zu bestimmen, werden sortierte OPCs mit Propidiumjodid (markiert tote Zellen) inkubiert und anschließend nochmals analysiert. Die Reinheit und Viabilität der sortierten Zellpopulation liegt bei >95%. (D) RNAseq Heat-Map: differentielle transkriptom-weite RNA-Expressionsanalyse von Präparationen von aufgereinigten Oligodendrozytenvorläuferzellen (OPC) und differenzierten Oligodendrozyten (OL). Modified from [3]t © 2017 Kroehne, Tsata, Marrone, Froeb, Reinhardt, Gompf, Dahl, Sterneckert and Reimer (CC BY 4.0).
  • Abb. 3: Oligodendrozytenvorläuferzellkulturen sind stabil unter Monokulturbedingungen. (A) Die Zellzahl der OPCs ist über einen Zeitraum von 10 Tagen in Kultur (DIC) stabil. (B) Nach 7 DIC exprimieren fast alle olig2:GFP positiven Zellen auch den Oligodendrozytenmarker Sox10. (DAPI-Kanal zeigt Zellkerne; Maßstab: 10 μm). From [3] Copyright © 2017 Kroehne, Tsata, Marrone, Froeb, Reinhardt, Gompf, Dahl, Sterneckert and Reimer (CC BY 4.0).

Oligodendrozyten (OL) sind die myelinisierenden Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS). Sie ermöglichen die saltatorische Erregungsleitung und versorgen ihre Axone mit Metaboliten. Im Gegensatz zu Neuronen finden sich Oligodendrozytenvorläuferzellen (OPCs) im Gewebe und besitzen auch im adulten Individuum die Fähigkeit der Differenzierung und Remyelinisierung.

Daher stellen endogene OPCs eine interessante Zellpopulation dar, um durch Aktivierung, etwa mittels „small molecules“, die Remyelinisierung nach Verletzungen zu verbessern und sowohl die saltatorische Erregungsleitung, als auch die langfristige Versorgung der myelinisierten Axone zu gewährleisten.

Beim Menschen kommt es nach Verletzungen des ZNS, z. B. nach Rückenmarksverletzungen, zu einer sekundären Demyelinisierung, die weit über die traumabedingte Zerstörung von OLs hinausgeht. Es bleiben demyelinisierte Axone zurück, die ihre Funktionalität verlieren und langfristig absterben. Die endogene Remyelinisierung nach Rückenmarksverletzungen ist nicht ausreichend um funktionserhaltend zu wirken. Interessanterweise findet sich bei manchen Wirbeltieren eine ausgeprägte funktionelle Erholung nach Rückenmarksverletzung, die Säugern fehlt [1,2]. Das gilt zum Beispiel für Zebrafische, die selbst nach einer vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks ein nahezu normales Schwimmverhalten zurückerlangen können. U. a. verläuft bei ihnen die Remyelinisierung sehr effektiv. Um die zugrundeliegenden zell-intrinsischen Abläufe genauer untersuchen zu können, wurde ein Zellkultursystem entwickelt, das auf primären OPCs basiert, die aus adultem Zebrafisch Rückenmark [3] gewonnen werden.

Diese OPCs befinden sich in einem inaktiven Zustand und besitzen eine regionale Identität. Im Gegensatz hierzu werden Säuger OPCs für in vitro Studien häufig aus iPSCs gewonnen. Während damit eine nahezu beliebige Skalierbarkeit erreicht werden kann, werden der inaktive Ruhezustand und die regionale Identität der OPCs hierbei nicht berücksichtigt. Die Gewinnung hochreiner OPC Primärkulturen aus Rückenmarksgewebe erfolgt durch Dissoziation und Sortierung mittels Durchflusszytometer (Abb. 1). Um die Unterscheidung der kleinen Zebrafischzellen von Zell-debris (v.

a. Myelin) zu ermöglichen wurde eine FACS-Strategie basierend auf der endogenen Fluoreszenz von OPCs (transgene Reporterlinien: olig2:dsRed und olig2:GFP) in Kombination mit einer fluoreszenten Lebendfärbung der Zellkerne angewendet (Abb. 2). Die aufgereinigten OPCs können für unterschiedliche Zwecke eingesetzt werden: (i) direkt für Sequenzierungsanalysen (Abb. 2), (ii) in Kokulturen mit Motorneuronen, (iii) für elektrophysiologische Messungen. Die über 10 Tage stabilen Monokulturen (Abb. 3) können in diesem Zeitraum auch zum Testen von „small molecules“ eingesetzt werden.

Präparation des Rückenmarks
Um das Rückenmark zu entnehmen, wurden adulte Zebrafische erst mit einer Überdosis des Betäubungsmittels MS222 getötet und danach dorsal eröffnet (TV 9/2016, Regierungspräsidium Dresden). Das Spinalgewebe von bis zu 5 Fischen wurde vorsichtig präpariert und in 1 mL Hanks´ Salzpuffer (HBSS, Gibco) zusammengeführt. Für die Einzelzelldissoziation wurde das Gewebes bei Raumtemperatur für 3 min mit 100 μL 0,25% Trypsin (Sigma)/1 mM EDTA blasenfrei in einer 200 μL Pipette auf und ab pipettiert. Der Verdau wurde durch Zugabe von 100 μL 20% FBS (Sigma) in 2 mM CaCl2 und 300 μL HBSS gestoppt. Danach wurde die Suspension mithilfe eines Zellsiebs geschert (Maschenweite: 20 μm (OPCs, Miltenyi Biotec) bzw. 35 μm (OL, Corning)). Das Zellsieb wurde nun mit 9 mL HBSS gewaschen und die Zellsuspension danach 5 min bei 300 g zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstands wurde das Pellet in 1 mL HBSS/ 1 μL Färbemittel (Vybrant DyeCycle Violet Stain, Molecular Probes, Invitrogen) resuspendiert und 30 min bei 28°C inkubiert.

Fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie (FACS)
Zellsuspensionen wurden direkt mit einem Durchflusszytometer (BD FACSAria) in mediumbefüllte 96-Well-Platten sortiert. Für die Detektion von GFP wurde ein 488 nm Laser und ein 530/30 Bandpass Filter verwendet. DsRed wurde mit einem 582/15 Bandpass Filter nach Anregung bei 561 nm detektiert. Vybrant Stain wurde nach Anregung bei 405 nm mit einem 540/40 Bandpass Filter detektiert. Um die Unterscheidung der Zebrafischzellen von Debris (Myelin) zu ermöglichen, wurden zur Festlegung der Gates sowohl das Vorwärts-Seitwärtsstreulicht-Profil, als auch das dsRed bzw. GFP-Signal, sowie das nukleäre Vybrant-Signal in Kombination herangezogen. Zur Beurteilung der Vitalität der Zellen wurde eine Färbung von toten Zellen mit 1 μg/mL Propidiumjodid durchgeführt.

Die OPC-Suspension kann direkt in verschiedenen Assays verwendet werden: z.B. unmittelbar für Transkriptomanalysen (RNAseq), in Monokulturen um undifferenzierte OPCs zu analysieren (Kulturdauer: ≤10 Tage) oder zusammen mit Motorneuronen in Kokulturen um die Differenzierung von Oligodendrozyten zu stimulieren (Kulturdauer: ≤16 Tage).

Deep Sequencing (RNAseq)
Die Probenvorbereitung für das RNAseq-Experiment wurde mit (SMARTer Ultra Low Input RNA for Illumina Sequencing KIT, Clontech) durchgeführt. Jeweils 2000 Zellen aus fünf biologischen Replikaten beider transgener Linien (Tg(olig2:eGFP) und Tg(mbp:eGFP)) wurden direkt in 5 μL Reaktionspuffer FACsortiert. Zur Erstellung der Libraries wurde ein Kit verwendet  (NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit, Illumina). Die Libraries wurden sequenziert (Hiseq2500, Illumina).

Basierend auf den Genexpressionslevels (Abb. 2) von kanonischen Markern der Oligodendrozytenlinie (olig1 and olig2) und Differenzierungsmarkern von reifen Oligodendrozyten (mbpa and mpz) können die OPC- und OL-Populationen (n=5) klar voneinander unterschieden werden. Dies bestätigt die Identität und den Differenzierungsstatus der aufgereinigten Zellpopulationen. Die Genexpressionslevel wurden durch Z-Transformation standardisiert um die Expressionsstärke der jeweiligen Transkripte direkt vergleichbar zu machen.

Kultivierung von OPCs
Eine 96-Well Platte wurde mit 10 μg/mL Poly-D-Lysine in DEPC H20 Lösung beschichtet (Merck Millipore) and steril über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Wells drei Mal mit DEPC H2O gewaschen und danach luftgetrocknet. Nun wurde eine 10 μg/mL Laminin in PBS Lösung zugegeben (Sigma Aldrich) und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am Tag der Präparation wurde die Lamininlösung abgesaugt und die Wells zwei Mal mit PBS und ein Mal mit H2O gewaschen. Nach Luftrocknung wurden die Wells mit 280 μL Leibovitz’s L-15 Medium (Gibco) supplementiert mit 15% FBS (Gibco, Performance Plus United States), 1% Glutamax (Gibco) und 1% pen/strep (Gibco) befüllt. Das Kulturmedium wurde ab dem dritten Tag in Kultur jeden zweiten Tag erneuert. Die Kulturen wurden bei 28°C im Brutschrank inkubiert.

Fazit
Die beschriebene Strategie zur Trennung, Aufreinigung und Kultivierung verschiedener Zellpopulationen aus dem Rückenmark des Zebrafischs, ermöglicht die Gewinnung hochwertiger Zellkulturen für weiterführende Analysen, wie Sequenzierungen, elektrochemische Untersuchungen oder Screening mit small molecules. Die Kombination aus Grundlagenforschung an regenerativen Modellorganismen und modernen Zellkultur- und Screeningverfahren wird den translationalen Ansatz pro-regenerativer Strategien verbessern und pharmakologisch nutzbar machen.
Danksagung

Wir danken der Deutsche Forschungsgemeinschaft (FZ 111 und EXC 168), dem DFG-Zentrum für Regenerative Therapien (CRTD) und der Technischen Universität Dresden für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit. Ferner folgenden Serviceeinrichtungen des CRTD: Fish Facility, FACS Facillity, Light Microscopy Facility und Deep Sequencing Facility.

Zugehörigkeiten
CMCB-Zentrum für Regenerative Therapien, Technische Universität Dresden, Dresden, Deutschland

Kontakt
Dr. Michell M. Reimer
CMCB-Zentrum für Regenerative Therapien
Technische Universität Dresden
Dresden, Deutschland

Referenzen
1. Reimer, M.M., et al., Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience, 2008. 28(34): p. 8510-8516. DOI:10.1523/JNEUROSCI.1189-08.2008

2. Reimer, M.M., et al., Sonic Hedgehog Is a Polarized Signal for Motor Neuron Regeneration in Adult Zebrafish. Journal of Neuroscience, 2009. 29(48): p. 15073-15082. DOI:10.1523/JNEUROSCI.4748-09.2009

3. Kroehne, V., et al., Primary Spinal OPC Culture System from Adult Zebrafish to Study Oligodendrocyte Differentiation In Vitro. Front Cell Neurosci, 2017. 11: p. 284

Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/
Chemgapedia-Lerneinheit zu FACS: http://www.chemgapedia.de/

Autor(en)

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George-Bähr-Str. 1-3
01069 Dresden
Deutschland

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