Photokonversion mittels Primed Conversion

Mit zwei Lichtstufen sieht man besser

  • Abb.1: Rote Fluoreszenz in zwei Schritten. Die Bildmontage zeigt im Hintergrund in extrem hochauflösender Mikroskopie zwei Proteine des Zellskeletts, die mit einer unveränderten Proteinvariante, Eos, mittels traditioneller Photokonvertierung (d.h. violettem Licht) sowie einer veränderten Form, pr-Eos2, mittels Primed Conversion (d.h. blaues und rotes Licht) sichtbar gemacht wurden. Modifiziert von: Mohr, M. A. et al. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 56, 11628–11633 (2017).Abb.1: Rote Fluoreszenz in zwei Schritten. Die Bildmontage zeigt im Hintergrund in extrem hochauflösender Mikroskopie zwei Proteine des Zellskeletts, die mit einer unveränderten Proteinvariante, Eos, mittels traditioneller Photokonvertierung (d.h. violettem Licht) sowie einer veränderten Form, pr-Eos2, mittels Primed Conversion (d.h. blaues und rotes Licht) sichtbar gemacht wurden. Modifiziert von: Mohr, M. A. et al. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 56, 11628–11633 (2017).
  • Abb.1: Rote Fluoreszenz in zwei Schritten. Die Bildmontage zeigt im Hintergrund in extrem hochauflösender Mikroskopie zwei Proteine des Zellskeletts, die mit einer unveränderten Proteinvariante, Eos, mittels traditioneller Photokonvertierung (d.h. violettem Licht) sowie einer veränderten Form, pr-Eos2, mittels Primed Conversion (d.h. blaues und rotes Licht) sichtbar gemacht wurden. Modifiziert von: Mohr, M. A. et al. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 56, 11628–11633 (2017).
  • Abb.2: Dreidimensionales Primed Conversion für die räumlich präzise optische Markierung von individuellen Neuronen. Die optische Selektion individueller Neuronen des Rückenmarks durch Primed Conversion erlaubt es - trotz der hohen Neuronendichte im lebenden Zierfisch - eine Nervenzelle und ihre feinen Fortsätze (in Magenta) zu visualisieren. Modifiziert von: Dempsey, W. P. et al. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Meth 12, 645–648 (2015).
  • Abb.3: Der molekulare Mechanismus von Primed Conversion. 488 nm “priming” Licht regt das grüne anionische Chromophor vom Grundzustand S0 in den angeregten Zustand S1 an. Nun kann entweder Fluoreszenz emittiert werden oder es erfolgt ein Übergang in einen energetisch niedrigen Triplett-Zustand T1. Die nachfolgende Anregung von T1 mit rotem bis infrarotem Licht führt zu einen angeregten Triplett-Zustand Tn mit darauffolgender Relaxation mittels eines photochemischen Prozesses in den roten Grundzustand S0. Mohr, M. A. et al. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 56, 11628–11633 (2017).

Die Einführung des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) als Marker in der Bildgebung im Jahre 1994 ermöglichte revolutionäre Einblicke in dynamische Proteinprozesse und fand somit vielfältige Anwendung in der biologischen und biomedizinischen Forschung [1]. Viele neue Proteine, die das ganze Farbenspektrum abdecken, wurden seitdem entwickelt und erfolgreich angewendet.

Darüber hinaus wurden auch Proteine eingeführt, die ihre Farbeigenschaften reversibel oder irreversibel mittels Licht spezieller Wellenlänge verändern können. Man unterscheidet dabei zwei Klassen: zum einen die Gruppe der photoaktivierbaren bzw. photowechselnden fluoreszierenden Proteine, die von einem nicht fluoreszierenden in einen fluoreszierenden Zustand übertreten können, und zum anderen die Gruppe der photokonvertierbaren fluoreszierenden Proteine, die ihre Farbeigenschaft mittels Licht von einem fluoreszierenden Zustand zu einem anderen fluoreszierenden Zustand wandeln können [2,3]. Die zweite Fluoreszenzgruppe ist von besonderer Bedeutung für die biomedizinische Bildgebung, da diese Proteine sowohl vor als auch nach der Photokonvertierung durchgehend sichtbar sind. Diese Eigenschaft erlaubt es, nicht konvertierte und konvertierte Proteinpopulationen parallel zu beobachten.

Photokonvertierbare Proteine

Die mit Abstand meistbenutzte Gruppe photokonvertierbarer Proteine ist die aus Anthozoa (Blumentiere) isolierten grün-zu-rot konvertierenden Fluoreszenzproteine. Kaede (Japanisch für Ahornblatt) war das erste Protein, das im Jahre 2002 von der Steinkoralle Trachyphyllia geoffroyi isoliert wurde [4]. Mittlerweile gibt es eine große Anzahl von grün-zu-rot photokonvertierbaren Proteingruppen, die eine erhöhte Helligkeit sowie effizientere Farbwandlung aufweisen. Alle Proteine, von der Kikumen-GR- [5], ClavGR- [6], Dendra- [7], über die Eos- [8] zur Maple-Proteingruppe [9], wandeln grüne Fluoreszenz mittels violettem Licht in rote Fluoreszenz um.

Der Mechanismus der Photokonvertierung mittels violettem Licht ist bei allen Proteingruppen gleich. Bei der Absorption von violettem Licht erfolgt eine C-C-Bindungsbrechung und die Formierung einer neuen C=C-Doppelbindung.

Diese neu gebildete Doppelbindung vergrößert das konjugierte Elektronensystem, das die Farbeigenschaft bestimmt, und bewirkt eine irreversible Konvertierung vom grünen in den roten fluoreszierenden Farbzustand [10].

Seit ihrer Einführung vor über 15 Jahren werden die grün-zu-rot photokonvertierbaren Fluoreszenzproteine erfolgreich als molekulare Marker in der biomedizinischen Bildgebung eingesetzt. Die Photokonvertierung von selektiven Proteinen, die mit grün-zu-rot wandelbaren Fluoreszenzproteinen markiert sind, hat es erlaubt ihre intrazelluläre Dynamik zu visualisieren [11]. Auch Zellorganellen, wie zum Beispiel Mitochondrien, konnten mittels Photokonvertierung untersucht werden [12]. Darüber hinaus konnten Zellengruppen in ihrer Entwicklung in Modellorganismen, wie zum Beispiel in Zierfischen [13] oder Mäusen [14], verfolgt werden. Darüber hinaus wurden die grün-zu-rot photokonvertierbaren Fluoreszenzproteine in zahlreichen Anwendungen der hochauflösenden Mikroskopie erfolgreich eingesetzt [15]. Es ist dabei aber anzumerken, dass eine präzise Photokonvertierung nur auf flache Gewebeproben und ebene Zellkulturen beschränkt war, da violettes Licht axial nicht begrenzt werden kann. Eine neue Form der Photokonvertierung wurde von unserer Arbeitsgruppe im Jahre 2015 vorgestellt [16]: das Fluoreszenzprotein Dendra2 konnte vom grünen in den roten Fluoreszenzzustand auch durch die simultane Beleuchtung mit blauem (488 nm) und rotem bis infrarotem Licht (730 nm) konvertiert werden. Wir bezeichnen diesen 2-Stufen-Mechanismus der Photokonvertierung als Primed Conversion. Bei Primed Conversion wird das Fluoreszenzprotein durch das blaue priming Licht (488 nm) in einen Anregungszustand, den primed Zustand, versetzt. In diesem Zustand kann es über mehrere Millisekunden verweilen, bevor es mittels Absorption von rotem bis infrarotem converting Licht (730 nm) irreversibel in den roten Farbzustand photokonvertiert wird. Die resultierende rote Form des Fluoreszenzproteins Dendra2 hat dabei das gleiche Emissionsspektrum wie bei der traditionellen Photokonvertierung mittels violettem Licht.

Mechanismus der Primed Conversion

Mittels Isotopenexperimenten konnten wir kürzlich den dahinterliegenden Mechanismus von Primed Conversion, und im Besonderen den primed Zustand, entschlüsseln [17]. Bei diesem Zustand handelt es sich um ein in der Quantenchemie bekanntes Phänomen, den sogenannten Triplett-Zustand. Nach rund fünf Millisekunden fällt das Fluoreszenzprotein Dendra2 wieder in seinen Grundzustand zurück. Zur Primed Conversion kommt es nur dann, wenn die zweite Stufe des Bescheinens mit rotem bis infrarotem Licht innerhalb des Triplett-Zeitfensters erfolgt (Abb. 3).

Die Lebensdauer des Triplett-Zustands hängt stark von der Stabilität des Farbproteins ab, und diese wird von der genauen Aminosäurenabfolge um das Chromophor (d.h. Farbzentrum des Proteins) beeinflusst. In einem systematischen Aminosäure-Screen deckten wir auf, dass die Aminosäurenposition 69 den Triplett-Zustand und somit Primed Conversion beeinflussen kann [17]. Die Einführung der polaren Aminosäure Threonin in die zentrale Position 69 war ausreichend, um alle bisher nicht zweistufig photokonvertierbaren Fluoreszenzproteine (d. h. Eos Familie, KikGR und Kaede) ebenfalls über Primed Conversion zu aktivieren. Die so veränderten Fluoreszenzproteine (nun definiert als pr-Eos Familie, pr-KikGR und pr-Kaede) sind nicht nur erstmals zweistufig schaltbar, auch sind sie stabiler und leuchten stärker, was die Anwendbarkeit von Primed Conversion für die biomedizinische Bildgebung sehr attraktiv macht.

Die ursprüngliche Entdeckung machten wir mit einem nicht-handelsüblichen Nah-Infrarotlicht-Laser (730 nm). Mittlerweile konnten wir aber zeigen, dass der Effekt auch mit handelsüblichen Rot-Lasern (ca. 640 nm) erfolgen kann [17]. Primed Conversion kann somit mit jedem Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden und ist somit von einer breiten Basis von Nutzern ohne extensive technische Anpassungen anwendbar.

Anwendung in der Mikroskopie

Primed Conversion kann in der Mikroskopie verwendet werden, um in einem Gewebe einen eng umrissenen Punkt zu markieren. Durch die präzise dreidimensionale Kreuzung von priming und converting Licht war es uns erstmals möglich, die Photokonvertierung axial zu begrenzen [16, 18]. Nur in diesem Kreuzungspunkt kommt es zu Primed Conversion. Da weder blaues noch rotes Laserlicht toxisch wirken, eignet sich diese Methode hervorragend für lebende Organismen. Diese wichtige Eigenschaft ermöglichte es uns, mit Primed Conversion einzelne Nervenzellen im Gehirn von lebenden Zierfischen visuell zu markieren [16] (Abb. 2).

Durch die Einführung neuer, verbesserter Fluoreszenzproteine für Primed Conversion wurden auch kürzlich Anwendungen in weiteren Mikroskopietechniken getestet. In der extrem hochauflösenden Mikroskopie wurden die neuen Proteine erfolgreich eingesetzt, um unterschiedliche Strukturen des Zellskeletts sichtbar zu machen. Dabei wurden parallel eine unveränderte Form des Fluoreszenzproteins Eos mittels traditioneller Photokonvertierung (d.h. violettem Licht) und eine veränderte Form, pr-Eos2, mittels Primed Conversion (d. h. blaues und rotes Licht) sichtbar gemacht [17] (Abb. 1).

Das bisherige Wissen nutzen wir, um in Zusammenarbeit mit ausgewiesenen Proteinexperten weitere in der Mikroskopie verwendete Farbproteine entsprechend zu verändern. Kürzlich haben wir in einer wissenschaftlichen Kooperation Proteine so verändert, dass sie lichtgesteuert einen genaktivierenden Botenstoff abspalten lassen können, und zwar so, dass die Lichtaktivierung mit zwei Farben erfolgen kann [19]. Mit der dreidimensional präzisen Primed Conversion könnte man in Zukunft gezielt Gene in einer einzelnen Zelle des Gewebes aktivieren. Außerdem lassen sich auch photokonvertierbare Proteine, die Kalzium detektieren, entsprechend verändern, um mit Primed Conversion zu reagieren [17]. Diese Proteine erlauben es, funktionelle Analysen durchzuführen und könnten zum Beispiel in der 3D-Hirnkartierung eingesetzt werden.

Autor
Periklis Pantazis

Kontakt  
Prof. Dr. Periklis Pantazis

Laboratory of Nano Bio Imaging
ETH Zürich
Zürich, Schweiz
Periklis.pantazis@bsse.ethz.ch
www.bsse.ethz.ch/nbi

Referenzen

[1] Pantazis, P. & Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 327–339 (2014).
[2] Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J. & Verkhusha, V. V. Photocontrollable Fluorescent Proteins for Superresolution Imaging. Annu. Rev. Biophys. 43, 303–329 (2014).
[3] Nienhaus, K. & Ulrich Nienhaus, G. Fluorescent proteins for live-cell imaging with super-resolution. Chem. Soc. Rev. 43, 1088–1106 (2014).
[4] Dempsey, W. P., Fraser, S. E. & Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS ONE 7, e32888 (2012).
[5] Dempsey, W. P. et al. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat. Methods 12, 645–648 (2015).
[6] Mohr, M. A. et al. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 56, 11628–11633 (2017).
[7] Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J. & Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science 305, 1007–1009 (2004).
[8] Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J. & Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science 322, 1065–1069 (2008).
[9] Mohr, M. A., Argast, P. & Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc 11, 2419–2431 (2016).
[10] Welling, M., Ponti, A. & Pantazis, P. Symmetry breaking in the early mammalian embryo: the case for quantitative single-cell imaging analysis. Mol. Hum. Reprod. 22, 172–181 (2016).
[11] Welling, M. et al. High fidelity lineage tracing in mouse pre-implantation embryos using primed conversion of photoconvertible proteins. bioRxiv 1–20 (2018). doi:10.1101/218354
[12] Klementieva, N. V. et al. Green-to-red primed conversion of Dendra2 using blue and red lasers. Chem. Commun. 52, 13144–13146 (2016).
[13] Turkowyd, B. et al. A General Mechanism of Photoconversion of Green-to-Red Fluorescent Proteins Based on Blue and Infrared Light Reduces Phototoxicity in Live-Cell Single-Molecule Imaging. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 56, 11634–11639 (2017).
[14] Virant, D., Turkowyd, B., Balinovic, A. & Endesfelder, U. Combining Primed Photoconversion and UV-Photoactivation for Aberration-Free, Live-Cell Compliant Multi-Color Single-Molecule Localization Microscopy Imaging. Int J Mol Sci 18, 1524 (2017).
[15] Zhang, W. et al. Optogenetic control with a photocleavable protein, PhoCl. Nat. Methods 14, 391–394 (2017).
[16] Pantazis, P. & Mohr, M. A. Primed conversion: the new kid on the block for photoconversion. Chemistry (2018). doi:10.1002/chem.201705651

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