Probennahme im Bioprozess

Ein notwendiges Übel oder eine Chance für effizientere Überwachung und Kontrolle?

  • Abb. 1: Das manuelle probenbasierte Monitoring stellt nach wie vor die Basis der Prozessüberwachung dar. Die Kombination mit ‘Standard PAT-Tools’ und ‘Advanced PAT-Tools’ haben die Bioprozesskontrolle weiterentwickelt, konnten jedoch probenbasierte Methoden nicht ersetzen. Daher führt der nächste Evolutionsschritt in PAT zu einem automatisierten probenbasierten Monitoring; einer Transformation von Offline zu Online-Methoden.Abb. 1: Das manuelle probenbasierte Monitoring stellt nach wie vor die Basis der Prozessüberwachung dar. Die Kombination mit ‘Standard PAT-Tools’ und ‘Advanced PAT-Tools’ haben die Bioprozesskontrolle weiterentwickelt, konnten jedoch probenbasierte Methoden nicht ersetzen. Daher führt der nächste Evolutionsschritt in PAT zu einem automatisierten probenbasierten Monitoring; einer Transformation von Offline zu Online-Methoden.
  • Abb. 1: Das manuelle probenbasierte Monitoring stellt nach wie vor die Basis der Prozessüberwachung dar. Die Kombination mit ‘Standard PAT-Tools’ und ‘Advanced PAT-Tools’ haben die Bioprozesskontrolle weiterentwickelt, konnten jedoch probenbasierte Methoden nicht ersetzen. Daher führt der nächste Evolutionsschritt in PAT zu einem automatisierten probenbasierten Monitoring; einer Transformation von Offline zu Online-Methoden.
  • Abb. 2: Zeitverlauf einer E. coli-Fermentation, bei welcher automatisiertes probenbasiertes Monitoring und inline OD Messung verglichen wurden. Die blaue Linie gibt den Zeitpunkt für den Temperaturshift gemäß der Inline-OD und die rote Linie gemäß der direkten Messung des primären Substrates Glukose an. Je nach angewandter Methode kann ein zeitlicher Unterschied des Temperaturshifts von über 2 h beobachtet werden.
  • Abb. 3: Die Umsetzung der beschriebenen Fallstudie ist hier schematisch dargestellt. Mithilfe des Multiplexermoduls wird eine Probe aus dem Bioreaktor entnommen, im Filtrationsmodul verarbeitet und im Autosampler abgelegt (Numera, Securecell). Mit einem Injektionsventil kann ein Teil der Probe direkt in das HPLC System (1200, Agilent) injiziert werden. Eine übergreifende Software (Lucullus PIMS, Securecell) steuert den Bioprozess, löst Probenahmen und Analysen aus, strukturiert Analyse- und Prozessdaten und ermöglicht letztendlich eine Feedback-Kontroll-Strategie.
Monitoring von biopharmazeutischen Prozessen
Monitoring und Kontrolle von kritischen Prozessparametern (CPPs) ist eine Voraussetzung, zur Gewährleistung sicherer Produkte und stellt die Kernaufgabe der prozessanalytischen Technologie (PAT) dar [1]. Die weitverbreitesten Methoden zur Prozessüberwachung basieren auf einer Probennahme und anschließender atline oder offline Analyse. Dieses probenbasierte Monitoring zeichnet sich durch zahlreiche Vorteile aus: spezifische Analyten können direkt gemessen werden; die eingesetzten offline Analysegeräte sind hoch automatisierbar; das Ergebnis ist vertrauenswürdig aufgrund der direkten Anwendung von Referenzmethoden; Parallelisierung wird ermöglicht; hohe Flexibilität ist gegeben und Referenzproben können für nachträgliche Analysen aufbewahrt werden [2].
Aufgrund dieser Vorzüge ist das probenbasierte Monitoring nach wie vor der Stand der Technik und z.B. für offline Prozesse wie Schüttelkolbenkulturen häufig die einzige Möglichkeit einer Überwachung. In Reaktorsystemen wird probenbasiertes Monitoring in der Regel in Kombination mit ‘Standard PAT-Tools’ (i.e. Inline-Sensoren für pH, pO2, T) angewendet. In den letzten Jahrzehnten gab es eine erhebliche Weiterentwicklung in Richtung ‘Advanced PAT-Tools’, zu welchen beispielsweise Abgasanalysatoren, dielektrische Spektroskopie, IR oder Raman zählen. Diese Sensoren liefern kontinuierliche Signale, welche in Verbindung mit mathematischen Modellen eine stete Prozessüberwachung und eine Verbesserung des Gesamtverständnisses von Bioprozessen ermöglichen. Aufgrund ihrer mangelnden Spezifität können sie das probenbasierte Monitoring jedoch nicht ersetzen (Abb. 1).
Trotz ihrer wesentlichen Bedeutung hat die manuelle Probenahme und Verarbeitung einige Nachteile: i) Die invasive Probennahme birgt ein Risiko für Kontaminationen des Prozesses und der Probe, ii) das manuelle Vorgehen benötigt ein größeres Probenvolumen iii) es gibt Operator bedingte Abweichungen während einzelner Probenahmen, der Probenverarbeitung und der Analyse, iv) die Prozessierung erfordert beträchtliche Ressourcen, v) die Frequenz der Probennahme ist häufig niedrig, vi) in der Regel stehen die Daten nicht in Echtzeit zur Verfügung und vii) das Datenmanagement ist oft papierbasiert und fehleranfällig.
 
Die Weiterentwicklung von PAT
Was ist nun der nächste notwendige Evolutionsschritt für PAT-Tools?

Fest steht, dass probenbasiertes Monitoring weiterhin ein essenzieller Teil der Bioprozesstechnik sein wird. Jedoch besteht ein erhebliches Potenzial in der Automatisierung probenbezogener Arbeitsschritte, wie der Probennahme, der Probenverarbeitung, der Probenanalyse sowie des Proben- und Daten Managements.

Eine durchdachte Automatisierung ermöglicht eine zuverlässige und sterile Probenahme mit einem minimal erforderlichen Volumen, reproduzierbare Ergebnisse ohne das Risiko menschlicher Fehler, eine hohe Frequenz der Probennahme und die Verfügbarkeit von Daten in Echtzeit ohne zusätzliches Personal. Darüber hinaus bietet die Automatisierung weiterhin alle Vorteile des üblichen manuellen probenbasierten Monitorings wie direkte Messungen, Aufbewahrung von Referenzproben und Multiplexing für parallele Ansätze.
In der folgenden Fallstudie wird ein Beispiel für die Überlegenheit des automatisierten probenbasierten Monitorings gezeigt.
 
Fallstudie
In der dargestellten Fallstudie wurde ein E. coli Prozess mit einem ‘Advanced PAT-Tool’, einem Inline-Sensor für die optische Dichte (OD), und mittels automatisierter Probennahme in Kombination mit einer Online-HPLC überwacht. Die gewonnen Daten wurden zur Kontrolle eines Temperaturshifts eingesetzt. Der Prozess wurde mit einem Autoinduktionsmedium durchgeführt, das für den aufeinanderfolgenden Verbrauch von Glucose und Glycerol als C-Quelle und Lactose als Induktor für die Proteinproduktion ausgelegt ist. Die Induktion beginnt nach dem Verbrauch von Glukose und mit Beginn der Laktoseaufnahme, welche den gewünschten Zeitpunkt für den Temperaturshift angibt. Ein weit verbreiteter Ansatz zur Bestimmung dieses Zeitpunkts ist die wiederholte (offline) Messung der OD, welche historisch betrachtet die am leichtesten verfügbare, wachstumsbezogene atline-Variable darstellt. Aufgrund der vorgenannten Nachteile des manuellen probenbasierten Monitorings ist diese einfache Steuerungsaufgabe ein ideales Anwendungsszenario für ‘Advanced PAT Tools’ wie die Inline-OD. Diese liefert ein kontinuierliches Signal, verfügt allerdings immer noch über einen reduzierten Informationsgehalt. In Abbildung 2 ist deutlich zu sehen, dass der Zeitpunkt für den Temperaturshift laut OD bei 4,5 h nicht mit der kompletten Verstoffwechselung von Glukose korreliert. Weiters ist das OD-Signal nicht optimal für Kontrolle geeignet, da es stark von der aktuellen Zellphysiologie abhängig ist und somit Varianzen über verschiedene Prozesse zeigt. Ein neuer Ansatz ist die automatisierte Probenahme und direkte Online-Analyse der Zucker mittels HPLC. Im Vergleich zur manuellen Probenahme ist eine hochfrequente und zuverlässige Analyse möglich, die alle 30 Minuten einen Konzentrationswert liefert. Vergleicht man beide Ansätze kann man eine drastische Verzögerung des optimalen Zeitpunkts für einen Temperaturshift von 2 h durch das probenbasierte Monitoring feststellen. Der entscheidende Unterschied beider Methoden liegt im angewandten Messprinzip. Im Gegensatz zur direkten Analyse der Zielgrößen durch den automatisierten probenbasierten Ansatz, verwenden die meisten ‘Advanced PAT-Tools’ Stellvertretergrößen wie die OD oder Spektren, die noch mit der eigentlichen Zielgröße korreliert werden müssen.
 
Automation und Digitalisierung
Um eine Kontrollstrategie, wie die Beschriebene, umsetzen zu können, müssen folgende Voraussetzungen erfüllt sein: Es bedarf i) eines zuverlässigen PAT-Tools und ii) eines Datenmanagement Systems. Dies inkludiert die Aufzeichnung von Prozess- sowie analytischen Daten, deren einheitliche Strukturierung, deren Auswertung und letztendlich die Umsetztung der Kontrollstrategie. Im beschriebenen Beispiel konnten diese Anforderungen mit der Kombination eines automatisierten Probenahmesystems (Numera, Securecell). einer Online-HPLC (1200, Agilen) und eines Prozessinformations- und management Systems (Lucullus PIMS, Securecell) erfüllt werden (Abb. 3).
Das automatisierte Probenahmesystem ist modular aufgebaut und ermöglicht eine online Analytik der Proben. Es besteht aus einem Multiplexer, welcher eine sterile Probenahme ermöglicht, einem Verdünnungs- und einem Filtrationsmodul zur Aufarbeitung der Probe und einem Autosampler zur Ablage und Weiterleitung der Probe. Ein Injektionsventil am Autosampler sorgt für eine direkte Injektion der Probe in das HPLC System. Das Prozessinformations- und management System löst die Probennahme und die dazugehörige Analytik zu einem vorgegebenen Zeitpunkt aus, wobei die HPLC Messung über ein Anstoßen der HPLC Software (ChemStation) gestartet wird. Die Konzentrationen der jeweiligen Analyten werden, wie üblich, über Peakintegration durch die HPLC Software bestimmt und anschließend direkt an das Prozessinformations- und management System weitergegeben. Dort können die Ergebnisse weiterverarbeitet und für die Initiierung eines Prozessevents herangezogen werden. In der beschriebenen Fallstudie wurde der Mittelwert der ersten fünf Glukose- und Laktosewerte bestimmt. Wenn die neuen Werte für beide Analyten mehr als 10% unter dem Mittelwert lagen, wurde der Temperaturshift automatisch eingeleitet. Hierbei wurde die Temperatur innerhalb von 45 Minuten von 37°C auf 25°C gesenkt.
 
Ausblick in die Zukunft
Automatisierte probenbasierte Prozessüberwachung ist die Plattformtechnologie für digitalisierte Bioprozesse. Dank ihr können Methoden der atline Analytik mit all ihren Vorteilen direkt am Prozess genutzt werden. Die direkte Messung der kritischen Prozessvariablen anstelle von Stellvertretergrößen eröffnet ungeahnte Möglichkeiten. Die Verfügbarkeit der benötigten Daten und daraus extrahierten Informationen in Echtzeit ermöglicht die sichere Anwendung modelbasierter Methoden. Dies wird die Bioprozesstechnologie revolutionieren. Neue CPPs und kritische Qualitätsattribute (CQAs) können direkt überwacht werden und führen unweigerlich zu neuen Kontrollstrategien die unter anderem kontinuierliche Prozesse ermöglichen. Prozessrobustheit, Effizienz und Entwicklungszeiten werden sich drastisch verbessern.
 

Autoren
Lukas Neutsch1, Alexandra Hofer2, Paul Kroll2

Zugehörigkeiten
1 Securecell AG, Schlieren, Schweiz
2 Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften (ZHAW), Life Sciences und Facility Management, Fachgruppe Bioprozesstechnologie, Wädenswil, Schweiz

Kontakt
Dr. Alexandra Hofer

Securecell AG 
Schlieren, Schweiz  
alexandra.hofer@securecell.de
 

Mehr Artikel

References
[1] US FDA. Guidance for industry PAT-A framework for innovative pharmaceutical development, manufacturing and quality assurance.
[2] Kroll P. et al. (2014). Ex situ online monitoring: application, challenges and opportunities for biopharmaceutical processes. Pharm. Bioprocess. 2(3), 285-300

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Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften


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