Programmierbare Bakteriophagen für die Medizin

Wie synthetische Biologie der Phagentherapie neuen Antrieb verleiht

  • Künstlerische Darstellung der Produktion therapeutischer Designerphagen welche aus modularen, massgeschneiderten Einzelteilen zusammengesetzt werden (Acrylfarben auf Leinwand). Das Bild zeigt wie ein einzelnes Phagengerüst benutzt wird um chimäre Partikel mit unterschiedlichen Spezifitäten herzustellen. © Jonas Fernbach (Instagram: @colorblind.arts)Künstlerische Darstellung der Produktion therapeutischer Designerphagen welche aus modularen, massgeschneiderten Einzelteilen zusammengesetzt werden (Acrylfarben auf Leinwand). Das Bild zeigt wie ein einzelnes Phagengerüst benutzt wird um chimäre Partikel mit unterschiedlichen Spezifitäten herzustellen. © Jonas Fernbach (Instagram: @colorblind.arts)
  • Künstlerische Darstellung der Produktion therapeutischer Designerphagen welche aus modularen, massgeschneiderten Einzelteilen zusammengesetzt werden (Acrylfarben auf Leinwand). Das Bild zeigt wie ein einzelnes Phagengerüst benutzt wird um chimäre Partikel mit unterschiedlichen Spezifitäten herzustellen. © Jonas Fernbach (Instagram: @colorblind.arts)
  • Abb. 1: Methodenüberblick. Synthetische Phagengenome werden in vitro aus circa 10 Kilobasen langen DNA Stücken zusammengebaut und anschliessend in Leihmutter-Zellen transformiert. Dies geschieht entweder via Elektroporation (Gram-negative Bakterien) oder via Polyethylenglycol (PEG)-transformation (Gram-positive Bakterien, L-formen). Die Leihmutter-Zellen produzieren die Designer-Phagen, welche anschliessend vermehrt und isoliert werden.
  • Abb. 2: L-form Bakterien. Mikroskopische Aufnahme von Enterococcus faecalis L-form Bakterien. L-formen werden benutzt um synthetische Phagengenome zu Aktivieren. L-form Zellen sind sehr unterschiedlich gross und besitzen intrazelluläre Vesikel. Massstabsbalken = 25 μm. Bild: Susanne Meile
  • Abb. 3: Rezeptorbindeprotein des Listeria Phagen PSA. Bändermodell der C-terminalen Domäne des Rezeptorbindeproteins des Listeria Phagen PSA.  Eine Proteinkette des homotrimeren Komplexes ist blau angefärbt. Die globuläre «Kopf»-Domäne enthält die Bindestellen, welche spezifische Teichonsäuren auf der Oberfläche von Listeria-Zellwänden erkennt. Durch den Austausch verschiedener Module mit Sequenzen von anderen RBPs kann die Spezifität von PSA umprogrammiert werden [11].
  • Abb. 4: Programmierbare Spezifität und in situ Produktion therapeutischer Proteine. Die Binde- und Infektionsspezifität von Phagen kann durch gezieltes Engineering von Rezeptorbindeproteinen verändert werden (oberes Panel). Durch das Einfügen therapeutischer Gene (z.B. Biofilm Depolymerasen oder antimikrobielle Lysine) können Phagen auch als Vektoren benutzt werden, um Therapeutika direkt an der Infektionsstelle herzustellen (unteres Panel).
Phagen werden zur Bekämpfung bakterieller Infekte genutzt, fristen aber seit der Entdeckung von Penicillin ein Schattendasein. Aufgrund der Antibiotikakrise interessiert sich die Forschung wieder für diese in Vergessenheit geratene Therapie. Bisher wurden Phagen aus der Umwelt isoliert, auf ihre antimikrobielle Aktivität geprüft und verabreicht. Mittels neuer Methoden aus der synthetischen Biologie ist es nun möglich, Phagen für therapeutische Zwecke umzuprogrammieren. Davon erhoffen sich die Forscher neue Ansätze zur Bekämpfung resistenter Keime.
 
Bakteriophagen (kurz: Phagen) sind Viren, die ausschliesslich Bakterien befallen. Phagen spielen in der bakteriellen Ökologie eine unglaublich wichtige Rolle, alleine in den Weltmeeren finden jede Sekunde schätzungsweise 1023 Infektionen statt wodurch täglich 20% der marinen Biomasse vernichtet wird [1]. Das therapeutische Potential von Phagen wurde kurz nach ihrer Entdeckung im Jahr 1915 erkannt und führte zu einer frühen Glanzzeit der Phagentherapie, die bis zur Entdeckung von Penicillin im Jahr 1928 andauerte. Heute wird diese Therapieform nur noch in wenigen Ländern praktiziert, vor allem in Georgien, wo sie zur täglichen medizinischen Praxis gehört [2]. Dieser Niedergang ist der einfachen Anwendbarkeit und der hohen therapeutischen Wirksamkeit konventioneller Antibiotika geschuldet. Aufgrund der wachsenden Bedrohung durch multiresistente Keime sucht die Forschung allerdings wieder vermehrt nach Alternativen – so erlebt die Phagentherapie zur Zeit ihren zweiten Frühling. Zahlreiche, zum Teil spektakuläre Fallstudien lassen das Potential dieser Therapieform erahnen [3, 4]. So wurde zum Beispiel letztes Jahr eine disseminierte Infektion mit Antibiotika-resistenten Mykobakterien erfolgreich behandelt – und zwar mit Hilfe von umprogrammierten Phagen [3]. Noch fehlt es aber an aussagekräftigen klinischen Studien welche die Wirksamkeit der Phagentherapie wissenschaftlich belegen [5].
Gegenüber herkömmlichen Antibiotika bieten Phagen einen entscheidenden Vorteil: Sie besitzen eine sehr hohe Wirtsspezifität und können daher Pathogene spezifisch ausschalten ohne dabei das Mikrobiom negativ zu beeinflussen.

Es gibt aber auch einige gewichtige Nachteile: Phagen sind so spezifisch, dass oft viele verschiedene Isolate kombiniert werden müssen, um einen Grossteil der klinisch relevanten Wirtsstämme abdecken zu können. Hinzu kommt, dass Wirtsbakterien durch Rezeptormutationen, Restriktionssysteme, CRISPR-Cas Systeme sowie aufgrund anderer Mechanismen Phagen-resistent werden können [6]. Einige, sogenannte temperente Phagen können sich auch ins Wirtsgenom integrieren und dabei potentiell gefährliche Gene in das Wirtsbakterium einbringen (ein als «lysogene Konversion» bekannter Prozess). Hinzu kommt, dass viele Bakterien für Phagen schwer zugänglich sind, da sie sich zum Beispiel in Biofilmen oder kapsulären Strukturen schützen.

Phagentherapie 2.0 – Synthetische Phagen für die Medizin

Durch genetisches Phagen Re-Engineering können viele der oben genannten Einschränkungen umgangen werden. Die dafür notwendigen Technologien wurden in den letzten Jahren entwickelt [7] Phagengenome werden dabei in kleinere Stücke aufgeteilt, welche entweder mittels PCR oder Gensynthese hergestellt werden. Diese synthetischen Genomfragmente werden dann mit Hilfe der Gibson Technik [8] wieder zu ganzen, infektiösen Phagen-genomen zusammengebaut (Abb. 1). Dieser Ansatz ermöglicht es genetisch veränderte Genome schnell und präzis herzustellen. Dadurch wird es möglich toxische Phagen-Gene zu eliminieren, wünschenswerte Gene einzufügen oder bereits vorhandene Funktionen anzupassen. Wie kommt man allerdings vom synthetischen Genom zum infektiösen Phagen?
Für Phagen von Enterobakterien ist es oftmals ausreichend die synthetischen Genome in elektrokompetente E. coli Bakterien zu transformieren, welche als bakterielle «Leihmütter» fungieren und die infektiösen Phagenpartikel produzieren [9]. Bei Gram-positiven Bakterien ist dies anspruchsvoller, da ganze Phagengenome nur schwer durch die dicke Zellwand zu transformieren sind. Für Gram-positive liegt die Lösung des Problems in einer wenig bekannten, biologischen Kuriosität: Viele Bakterien besitzen die Fähigkeit auch ohne Zellwand zu wachsen und sich zu teilen, zumindest solange sie sich nicht unter osmotischem Stress befinden. Diese sogenannten L-form Bakterien (benannt nach dem Lister Institut in London, siehe Abb. 2) sind leicht transformierbar und funktionieren auch hervorragend als Leihmütter für die Aktivierung synthetischer Phagengenome [10]. Mit Hilfe von Listeria L-formen wurde bereits gezeigt, dass synthetische Phagengenome effizient aktiviert werden können und zwar nicht nur für Listeria sondern auch über die Genus-Grenze hinaus (z.B. für Phagen von Staphylokokken) [10]. Mit Hilfe von kompetenten Leihmutter-Zellen (elektrokompetent oder L-formen) ist es also möglich synthetische Genome rasch zu aktivieren – ein Prozess der auch als «genome rebooting» bekannt ist.
Früher war Phagen Re-Engineering nur mittels homologer Rekombination in geeigneten Wirtszellen möglich. Die Rekombinationsfrequenzen sind bei diesen Experimenten allerdings meist sehr niedrig und die Isolation von rekombinanten Phagen daher ein schwieriger und vor allem langwieriger Prozess. Die neuen Methoden sind also ein grosser Schritt nach vorne. Optimierte Designerphagen können innerhalb weniger Tage bis Wochen hergestellt und isoliert werden. Was aber kann damit erreicht werden? Die nächsten beiden Paragraphen zeigen mögliche therapeutische Anwendungen von Designerphagen.

Programmierbare Wirtsspezifität

Wie bereits angesprochen, ist die hohe Wirtsspezifität der Phagen Fluch und Segen zugleich. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die oben vorgestellten Methoden benutzt werden können, um die Phagenspezifität umzuprogrammieren [9, 11-13]. Dies gelingt vor allem durch das Verändern sogenannter Rezeptorbindeproteine (RBPs), welche Zucker und/oder Proteinstrukturen auf den Zellwänden der Bakterien binden. Rezeptorbindung ist der erste Schritt im Infektionszyklus und primär für den engen Wirtsbereich der meisten Phagen verantwortlich. Die Spezifitäten von Enterobacteriacea- sowie von Listeria Phagen wurden bereits verändert durch die Erzeugung synthetischer Phagen mit chimären RBPs. Solche chimären RBPs werden aus einzelnen strukturellen Bausteinen zusammengesetzt, ganz nach dem LEGO-Prinzip. Hierzu benötigt man einerseits die molekulare Struktur des RBPs als Bauplan (Abb. 3) und andererseits passende LEGO-Bausteine von verwandten Phagen mit abweichender Spezifität. Mit dieser Methode könnte es in Zukunft möglich werden das Wirtsspektrum von bekannten und gut charakterisierten Phagen anzupassen, anstatt jedes Mal neue Phagen aus der Umwelt zu isolieren (Abb. 4).

In situ Produktion therapeutischer Proteine

Viele Phagen-Gene stehen unter der Kontrolle von hochaktiven Promotoren. Dies ist notwendig, um neue Phagenpartikel zu bilden, wozu innert kurzer Zeit grosse Mengen von Strukturproteinen hergestellt werden müssen. Nun ist es möglich Phagen so umzuprogrammieren, dass sie während der Infektion nebst den Strukturproteinen auch therapeutische Gene exprimieren (Abb. 4). Nach dem Tod der Wirtszelle werden diese Proteine freigesetzt und entfalten ihre Wirkung lokal. Phagen wurden zum Beispiel bereits so programmiert, dass sie Depolymerasen herstellen welche entweder Poly-N-acetylglucosamine (PNAG) oder kapsuläre Polysaccharide auflösen [14, 15]. Dadurch zeigen diese Designer-phagen eine verbesserte Aktivität gegen PNAG-haltige Biofilme und Exopolysaccharid produzierende Bakterien.
In einer anderen Konzeptstudie wurden Listeriaphagen konstruiert, welche ein Staphylokokken Bakteriozin herstellen. Wird eine Ko-Kultur von Listerien und Staphylokokken mit diesen Phagen infiziert, so sterben beide Keime ab. Dabei werden zuerst die Listerien direkt infiziert und die Staphylokokken dann durch das freigesetzte Bakteriozin via «Kollateralschaden» abgetötet [16]. Diese Herangehensweise eröffnet Möglichkeiten zur Behandlung polymikrobieller Infektionen, welche gerade bei Harnwegsinfekten oder Wundinfektionen häufig sind.

Ausblick

Die Phagentherapie steht vor aufregenden Zeiten: Viele Firmen und öffentliche Institutionen investieren einerseits in die Entwicklung personalisierter Therapieformen und andererseits in klinische doppelblind Studien, meistens mit Mischungen von natürlichen Phagen [5]. Auch die synthetischen Designerphagen kommen auf den Prüfstand: So investierte der Schweizer Nationalfonds kürzlich in ein grossangelegtes Projekt zur Behandlung von Harnwegsinfekten bei katheterisierten Patienten [17]. Die Resultate dieser Studien werden richtungsweisend sein, um die Rolle der Phagentherapie im Kampf gegen antibiotikaresistente Keime zu definieren.

Autoren
Matthew Dunne1 und Samuel Kilcher1

Zugehörigkeit
1Institut für Lebensmittelwissenschaften, Ernährung und Gesundheit, Labor für Lebensmittel Mikrobiologie, ETH Zürich, Schweiz

Kontakt
Dr. Samuel Kilcher
Gruppenleiter am Institut für Lebensmittelwissenschaften, Ernährung und Gesundheit
Labor für Lebensmittel Mikrobiologie
ETH Zürich, Schweiz
samuel.kilcher@hest.ethz.ch

Literatur
[1] Suttle, C.A. (2007) Marine viruses--major players in the global ecosystem. Nat Rev Microbiol 5 (10), 801-12.
[2] Kutter, E. et al. (2010) Phage therapy in clinical practice: treatment of human infections. Curr Pharm Biotechnol 11 (1), 69-86.
[3] Dedrick, R.M. et al. (2019) Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat Med 25 (5), 730-733.
[4] Schooley, R.T. et al. (2017) Development and Use of Personalized Bacteriophage-Based Therapeutic Cocktails To Treat a Patient with a Disseminated Resistant Acinetobacter baumannii Infection. Antimicrob Agents Chemother 61 (10).
[5] Schmidt, C. (2019) Phage therapy's latest makeover. Nat Biotechnol 37 (6), 581-586.
[6] Labrie, S.J. et al. (2010) Bacteriophage resistance mechanisms. Nat Rev Microbiol 8 (5), 317-27.
[7] Kilcher, S. and Loessner, M.J. (2018) Engineering Bacteriophages as Versatile Biologics. Trends Microbiol.
[8] Gibson, D.G. et al. (2009) Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods 6 (5), 343-5.
[9] Ando, H. et al. (2015) Engineering Modular Viral Scaffolds for Targeted Bacterial Population Editing. Cell Syst 1 (3), 187-196.
[10] Kilcher, S. et al. (2018) Cross-genus rebooting of custom-made, synthetic bacteriophage genomes in L-form bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A 115 (3), 567-572.
[11] Dunne, M. et al. (2019) Reprogramming Bacteriophage Host Range through Structure-Guided Design of Chimeric Receptor Binding Proteins. Cell Rep 29 (5), 1336-1350 e4.
[12] Yehl, K. et al. (2019) Engineering Phage Host-Range and Suppressing Bacterial Resistance through Phage Tail Fiber Mutagenesis. Cell 179 (2), 459-469 e9.
[13] Yosef, I. et al. (2017) Extending the Host Range of Bacteriophage Particles for DNA Transduction. Mol Cell 66 (5), 721-728 e3.
[14] Lu, T.K. and Collins, J.J. (2007) Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage. Proc Natl Acad Sci U S A 104 (27), 11197-202.
[15] Born, Y. et al. (2017) Engineering of Bacteriophages Y2::dpoL1-C and Y2::luxAB for Efficient Control and Rapid Detection of the Fire Blight Pathogen, Erwinia amylovora. Appl Environ Microbiol 83 (12).
[16] Hupfeld, M. et al. (2018) A functional type II-A CRISPR–Cas system from Listeria enables efficient genome editing of large non-integrating bacteriophage. Nucleic Acids Res 46 (13), 6920-6933.
[17] BalgristHospital, Treatment of urinary tract infections with ‘bacteria killers’, SNSF support for an innovative research project, Balgrist University Hospital, Zürich, 2019, p. 1.

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