Proteindynamik

Hochauflösende Fluoreszenzsonden

  • Abb. 1. Das Funktionsprinzip einer PET Fluoreszenzsonde. (A) Farbstoff (F) und die Seitenkette von Trp bilden stapelnde π-π- Wechselwirkungen in wässriger Lösung. Die Fluoreszenz des elektronisch angeregten F (hν) wird durch PET von Trp zu F gelöscht. (B) Abstandsabhängigkeit eines PET- verglichen mit einem FRET-Fluoreszenzsignal. Die charakteristische Ortsskala, auf der die Sonden aktiv sind, ist angezeigt (RPET, RFRET).Abb. 1. Das Funktionsprinzip einer PET Fluoreszenzsonde. (A) Farbstoff (F) und die Seitenkette von Trp bilden stapelnde π-π- Wechselwirkungen in wässriger Lösung. Die Fluoreszenz des elektronisch angeregten F (hν) wird durch PET von Trp zu F gelöscht. (B) Abstandsabhängigkeit eines PET- verglichen mit einem FRET-Fluoreszenzsignal. Die charakteristische Ortsskala, auf der die Sonden aktiv sind, ist angezeigt (RPET, RFRET).
  • Abb. 1. Das Funktionsprinzip einer PET Fluoreszenzsonde. (A) Farbstoff (F) und die Seitenkette von Trp bilden stapelnde π-π- Wechselwirkungen in wässriger Lösung. Die Fluoreszenz des elektronisch angeregten F (hν) wird durch PET von Trp zu F gelöscht. (B) Abstandsabhängigkeit eines PET- verglichen mit einem FRET-Fluoreszenzsignal. Die charakteristische Ortsskala, auf der die Sonden aktiv sind, ist angezeigt (RPET, RFRET).
  • Abb. 2. Einsatz von PET Fluoreszenzsonden zur Messung von Konformationsdynamik des Chaperons Hsp90. (A) Hsp90 ist ein Dimer bestehend aus zwei identischen Untereinheiten und ähnelt einer molekularen Klammer (N: N-terminale, M: mittlere und C: C-terminale Domäne). Die beweglichen Strukturelemente (β-Faltblatt, magenta; Deckel, grün) sind hervorgehoben. PET Fluoreszenzsonden, bestehend aus Farbstoff (rote Kugeln) und Trp (blaue Kugeln), machen die Bewegungen des Klammerschlusses (induziert durch Binden von AMP-PNP, gelbe Kugeln) sichtbar. (B) Die Bewegung des β-Faltblatts wird durch den zeitlichen Fluoreszenzabfall nach Zugabe von AMP-PNP (Zeitpunkt 0 Min) sichtbar. Das Kontrollexperiment ohne eingebautes Löschmolekül Trp ist in grau gezeigt. (C) Die ermittelten Ratenkonstanten der Strukturänderungen ähneln der ATPase Aktivität von Hsp90. Die Abbildung wurde aus Ref. 4 adaptiert.
  • Abb. 3.: Sichtbarmachung schneller Dynamik des Deckels von Hsp90 mittels PET-FCS. (A) Kristallstruktur der N-terminalen Domäne. Das gebundene Nukleotid (orangene Stäbchen), der Deckel (grünes Segment) und die eingebrachte PET Fluoreszenzsonde (Farbstoff: rote Kugel; Trp: blaue Stäbchen) sind hervorgehoben. (B) Autokorrelationsfunktionen (G(τ)) dreier PET-FCS Messungen (grün: Hsp90 ohne Bindungspartner; cyan: Hsp90 nach Bindung von Aha1; orange: Hsp90 nach Bindung von ATP). Der Pfeil zeigt auf die veränderliche Mikrosekunden Dynamik des Deckels. (C) Die Ratenkonstante der Ablösung des Deckels erhöht sich durch Binden von ATP und Aha1. Die Abbildung wurde aus Ref. 4 adaptiert.

Proteine galten lange Zeit als starre Strukturen, jedoch verändern sie ihre Gestalt ständig und erfüllen dadurch wichtige Funktionen in der Natur. Eine neue Fluoreszenztechnik ermöglicht es, Proteindynamik mit hoher Orts- und Zeitauflösung sichtbar zu machen. Hierbei wird ein Farbstoffmolekül in Nachbarschaft zur natürlichen Aminosäure Tryptophan an ein Protein geheftet und Bewegungen des Proteins durch Modulation kontaktinduzierter Fluoreszenzlöschung detektiert.

Mit dem fluoreszenzbasierten „Bewegungsmelder“ können in Kombination mit Einzelmolekültechniken Konformationsänderungen im molekularen Chaperon Hsp90 mit Ein-Nanometer Orts- und Nanosekunden Zeitauflösung sichtbar gemacht werden.

Proteine
Proteine sind die wichtigsten molekularen Funktionsträger des Lebens. Im menschlichen Körper verrichten mehr als 20.000 verschiedene Proteine ihre Arbeit als molekulare Maschinen, Strukturbildner, Transporter oder Signalgeber. Die Vielfalt von Proteinfunktion basiert auf der astronomisch großen Zahl möglicher Aminosäuresequenzen, die die biologische Synthesemaschinerie generieren kann. Als Polypeptide werden Proteine an Ribosomen synthetisiert, wo eine lineare Abfolge von Nucleobasen kodierender Ribonucleinsäuren in eine Sequenz von Aminosäuren übersetzt wird. Das native Polypeptid faltet meist spontan in eine hochgeordnete, dreidimensionale Struktur, die die funktionale Einheit darstellt. Strukturbestimmende Methoden, wie Röntgenkristallographie (X-ray), kernmagnetische Resonanz (NMR) und elektronenmikroskopische Verfahren (Cryo-EM), liefern atomar oder nah-atomar aufgelöste Bilder von Proteinen. Die Struktur eines Proteins ist jedoch zeitlich veränderlich und die Dynamik dieser Strukturänderung oft von großer Bedeutung für die Funktion.

Dynamik sichtbar machen
Konformationelle Bewegungen von Proteinen sichtbar zu machen ist ein erklärtes Ziel der Biophysik. Hierdurch lassen sich Funktionsmechanismen und fehlgeleitete Proteinfunktion verstehen, die den Schlüssel zu pharmakologischer Intervention bei Erkrankungen liefern kann. Es wurde eine Fluoreszenztechnik entwickelt, die Strukturänderungen in Proteinen mit hoher Orts- und Zeitauflösung beobachtbar macht.

Hierbei wird ein organisches Farbstoffmolekül in Nachbarschaft zur natürlichen Aminosäure Tryptophan (Trp) an ein Protein geheftet. Dies gelingt durch ortsspezifischen Einbau einer reaktiven Aminosäureseitenkette mittels Mutagenese und nachfolgend chemischer Modifikation mit dem Farbstoff. Sind Farbstoffmolekül und Trp in Kontakt, so wird das Fluoreszenzlicht des Farbstoffs durch photoinduzierten Elektronentransfer (PET) gelöscht [1] (Abb. 1A). Wird der Kontakt zwischen Farbstoff und Trp durch Änderung der Proteinstruktur aufgehoben, so kann die PET-Reaktion nicht mehr stattfinden und der Farbstoff leuchtet. Die Farbstoff/Trp Reporterkassette erzeugt somit einen „Lichtschalter“, der durch eine definierte Konformationsänderung im Protein getätigt wird. Da der Abstand zwischen Farbstoff und Trp bei Kontaktbildung kleiner als ein Nanometer (≤1 nm) sein muss, lassen sich lokale Konformationsänderungen in Proteinen beobachten. Dies können Änderungen der Sekundär-, Tertiär- oder Quartärstruktur sein. Die PET Fluoreszenztechnik komplementiert den populären Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) der auf der 2-5-nm Ortsskala aktiv ist (Abb. 1B). Durch Einbringen der Sonde an unterschiedlichen Stellen in ein und demselben Protein lassen sich Konformationsänderungen von mehreren Orten gleichzeitig messen. Die Summe der lokalen Strukturänderungen zeichnet ein globales Bild der Dynamik. Allosterische Kommunikation wird sichtbar.

Methoden
Proteine geben ihre Dynamik jedoch meist nicht ohne weiteres preis [2]. Thermisch aktivierte Fluktuationen der Proteinstruktur, die unter Gleichgewichtsbedingungen stattfinden, sind mit konventionellen Methoden nur schwer zu beobachten. Die astronomische Größe der Avogadro-Zahl (NA = 6 x 1023) lehrt uns, dass wir selbst in hochverdünnten Lösungen stets ein sehr große Anzahl von Molekülen gleichzeitig beobachten. Die Bewegung jedes einzelnen Moleküls ist ein stochastischer Prozess und wird durch die große Zahl gleichzeitig beobachteter Moleküle verschleiert. Die Kombination von PET Fluoreszenzlöschung mit Einzelmolekülspektroskopie löst das Problem. Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (engl.: „fluorescence correlation spectroscopy“, FCS) misst Fluoreszenzfluktuationen vom Einzelmolekül auf einem Hintergrund einer auseichend kleinen Zahl benachbarter Moleküle. Durch Kombination von FCS mit PET (PET-FCS) lassen sich stochastische Fluktuationen der Proteinstruktur in Fluoreszenzfluktuationen übersetzen, die in der Autokorrelationsfunktion bis in den Zeitbereich von Nanosekunden sichtbar werden [3].

Chaperone
Wir haben die PET Fluoreszenztechnik angewandt, um Bewegungen eines speziellen Proteins sichtbar zu machen, die anderen Methoden bisher verborgen blieben [4]. Das 90-kDa Hitzeschockprotein Hsp90 ist ein molekulares Chaperon, das die Funktionsfähigkeit vieler Proteine in lebenden Zellen aufrecht hält. Als Helferprotein aktiviert Hsp90 seine Substrat Proteine, sogenannte Klienten, indem es deren Form (Konformation) verändert. Viele dieser Klienten sind an der zellulären Signalweiterleitung und Krankheitsentstehungen wie Krebs beteiligt. Der Mechanismus, durch den Hsp90 seine Klienten aktiviert, ist bisher nur teilweise verstanden. Das Chaperon ähnelt einer molekularen Klammer, die sich öffnet und schließt während der Klient aktiviert wird. Die Energie für diesen Vorgang liefert die Hydrolyse von ATP. Strukturbiologen haben mittels Röntgenbeugung am Kristall atomar aufgelöste Schnappschüsse des Chaperons in unterschiedlichen Stadien des Katalyse-Zyklus erhalten. Die Kristallstrukturen sagen Bewegungen lokaler Strukturelemente vorher, die jedoch in Lösung bisher nicht beobachtbar werden konnten. Wir haben diese Bewegungen nun sichtbar gemacht, indem wir die entsprechenden Strukturelemente mit PET Fluoreszenzsonden versehen und das Chaperon durch Zugabe von Nukelotid in die geschlossene Konformation überführt haben (Abb. 2). Der Einsatz des nicht-hydrolysierbaren ATP-Analogons AMP-PNP arretierte das Chaperon in der geschlossenen Klammerkonfiguration. Die Ähnlichkeit der erhaltenen Zeitkonstanten, die von Strukturänderungen an unterschiedlichen Stellen gemessen wurden, zeigte an, dass sich die untersuchten Strukturelemente synchron mit dem Klammerschluss bewegen. Es ist bekannt, dass das kooperierende Co-Chaperon Aha1 an Hsp90 bindet und den Katalyse-Zyklus beschleunigt. Mittels PET-FCS wurde ferner eine außerordentlich schnelle Dynamik bestimmter Strukturelemente sichtbar (Abb. 3). Die PET-FCS Messungen haben nun gezeigt, dass Aha1, neben den bereits bekannten Mechanismen der Aktivierung, in einer frühen Phase ein definiertes Strukturelement mobilisiert und somit das Chaperon für den Klammerschluss vorbereitet.

Fazit
Die Ergebnisse der PET Fluoreszenzspektroskopie am Chaperon Hsp90 haben gezeigt, dass die Methode neue Einblicke in die Dynamik und den Mechanismus komplexer molekularer Maschinen liefern kann. PET-FCS ist als Einzelmolekültechnik in der Lage, schnelle konformationelle Fluktuationen zu detektieren, die herkömmlichen Methoden verborgen bleiben.

Kontakt
Dr. Hannes Neuweiler
Lehrstuhl für Biotechnologie und Biophysik
Biozentrum Universität Würzburg
hannes.neuweiler@uni-wuerzburg.de

Referenzen:

1. Neuweiler, H. & Sauer, M. Using photoinduced charge transfer reactions to study conformational dynamics of biopolymers at the single-molecule level. Curr Pharm Biotechnol 5, 285-98 (2004). DOI:10.2174/1389201043376896

2. Henzler-Wildman, K. & Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature 450, 964-72 (2007), doi:10.1038/nature06522.

3. Sauer, M. & Neuweiler, H. PET-FCS: probing rapid structural fluctuations of proteins and nucleic acids by single-molecule fluorescence quenching. Methods Mol Biol 1076, 597-615 (2014), doi:10.1007/978-1-62703-649-8_27.

4. Schulze, A., Beliu, G., Helmerich, D. A., Schubert, J., Pearl, L. H., Prodromou, C. & Neuweiler, H. Cooperation of local motions in the Hsp90 molecular chaperone ATPase mechanism. Nat Chem Biol 12, 628-635 (2016), doi:10.1038/nchembio.2111.

Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/
Chemgapedia-Lerneinheit zur Fluoreszenz: http://www.chemgapedia.de/

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