Proteinkristallographie in der Alzheimerforschung

Einfluss der Reinstwasserqualität

  • Abb. 1: Katalysierte Reaktion von hQC und ihre Rolle in der Alzheimer Erkrankung. 1 (A) N-terminale Glutamine von kleinen Peptiden werden in einer irreversiblen Zyklisierungsreaktion zu Pyroglutamat modifiziert (physiologische Reaktion). Zusätzlich katalysiert das Enzym in einer pathophysiologischen Seitenreaktion auch Glutamate am N-Terminus von prozessierten Amyloid-ß Peptiden. (B) Das Transmembran-ständige APP Protein wird durch die Proteasen ß- und γ-Sekretase zu Aß-Peptiden prozessiert, welche ein N-terminales Glutamat vorweisen. Sobald es zu einer Kolokalisation der Aß-Peptide und der hQC kommt, werden diese N-terminalen Glutamate enzymatisch modifiziert.  © O.Kupski (2016) “Structure, Mechanism and Inhibition of Human Glutaminyl Cyclase“ (Dissertation), Seite 17Abb. 1: Katalysierte Reaktion von hQC und ihre Rolle in der Alzheimer Erkrankung. 1 (A) N-terminale Glutamine von kleinen Peptiden werden in einer irreversiblen Zyklisierungsreaktion zu Pyroglutamat modifiziert (physiologische Reaktion). Zusätzlich katalysiert das Enzym in einer pathophysiologischen Seitenreaktion auch Glutamate am N-Terminus von prozessierten Amyloid-ß Peptiden. (B) Das Transmembran-ständige APP Protein wird durch die Proteasen ß- und γ-Sekretase zu Aß-Peptiden prozessiert, welche ein N-terminales Glutamat vorweisen. Sobald es zu einer Kolokalisation der Aß-Peptide und der hQC kommt, werden diese N-terminalen Glutamate enzymatisch modifiziert. © O.Kupski (2016) “Structure, Mechanism and Inhibition of Human Glutaminyl Cyclase“ (Dissertation), Seite 17
  • Abb. 1: Katalysierte Reaktion von hQC und ihre Rolle in der Alzheimer Erkrankung. 1 (A) N-terminale Glutamine von kleinen Peptiden werden in einer irreversiblen Zyklisierungsreaktion zu Pyroglutamat modifiziert (physiologische Reaktion). Zusätzlich katalysiert das Enzym in einer pathophysiologischen Seitenreaktion auch Glutamate am N-Terminus von prozessierten Amyloid-ß Peptiden. (B) Das Transmembran-ständige APP Protein wird durch die Proteasen ß- und γ-Sekretase zu Aß-Peptiden prozessiert, welche ein N-terminales Glutamat vorweisen. Sobald es zu einer Kolokalisation der Aß-Peptide und der hQC kommt, werden diese N-terminalen Glutamate enzymatisch modifiziert.  © O.Kupski (2016) “Structure, Mechanism and Inhibition of Human Glutaminyl Cyclase“ (Dissertation), Seite 17
  • Abb. 2: Vergleich der verschiedenen Kristallisationsansätze mit Reinstwasser versus Leitungswasser als Basis.
  • Abb. 3: Struktur von hQC mit vergrößerter Darstellung des aktiven Zentrums. Zwei Moleküle der hQC kristallisieren pro asymmetrischer Einheit. Das aktive Zentrum befindet sich an der Proteinoberfläche des Enzyms, wie in der Vergrößerung abgebildet. Das Zinkion (Zn, schwarz), welches über drei hoch konservierte Aminosäuren koordiniert wird (blau), befindet sich am Boden der Bindetasche. Die vierte Koordinationsstelle wird von einem Wassermolekül besetzt (rot). Gestrichelte Linien zeigen die koordinative Bindung des Zinkion mit den dazugehörigen Bindungslängen in Ångström.

Die Alzheimer-Krankheit ist eine fortschreitende, neurodegenerative und bisher unheilbare Krankheit, welche insbesondere bei Personen im mittleren bis hohen Alter auftritt. Über diese Krankheit wurde erstmals vom deutschen Arzt Alois Alzheimer 1906 referiert. Im Jahr 1907 wurde sein Bericht über diese Krankheit publiziert [1], die später nach ihm benannt worden ist. Er führte eine Autopsie an dem Gehirn einer verstorbenen Frau im mittleren Alter durch, welche unter schweren Gedächtnisproblemen und Verwirrtheit litt, und identifizierte dabei dichte Ablagerungen rund um das Äußere der Nervenzellen.

In Deutschland leiden circa 1,2 Millionen Menschen unter dieser Krankheit, welche mit Gedächtnisverlust, dem Verlust der Sprachfähigkeit und des Urteilsvermögens, Veränderungen der Persönlichkeit sowie mit starken Stimmungsschwankungen einhergeht. In dieser wissenschaftlichen Projektstudie wird versucht, die molekularen Zusammenhänge der Entstehung der Alzheimer-Krankheit besser zu verstehen und Grundlagen für neue Therapieformen zu entwickeln.

Einleitung
Die Gehirne von Individuen mit fortgeschrittenen Alzheimer-Symptomen sind durch verstärkte Ablagerungen von Amyloid-β-Peptiden (Aβ), auch Plaques genannt, in den neokortikalen Gehirnregionen gekennzeichnet [2], welche die Auslöser für die bereits erwähnten Symptome sind. Die Entstehung dieser Plaques wird begünstigt durch eine sequentielle Prozessierung des Amyloid-Vorläufer-Proteins (APP) durch die Enzyme β- und γ-Sekretase (Abb. 1B). Das Resultat dieser proteolytischen Prozessierung sind Aβ-Peptide verschiedener Länge, welche jeweils ein N-terminales Glutamat in ihrer Sequenz vorweisen. Dieses N-terminale Glutamat unterliegt einer sehr langsamen spontanen Zyklisierungsreaktion zu Pyroglutamat (pGlu) (kcat = 10-9 s-1; ca. 1 Molekül alle 36 Jahre) [3], und weist danach nicht mehr die basischen Eigenschaften eines Peptid-N-Terminus auf. Als Folge dieser Modifikation werden neben Hydrophobizität und proteolytischer Stabilität die Neurotoxizität der Aβ-Peptide drastisch erhöht. Modifizierte Aβ-Peptide tendieren zur Oligomerisierung und in Folge zur Ausbildung von Plaques im Gehirn, welche im fortgeschrittenen Stadium zu einer funktionellen Störung der neuronalen Kommunikation führen.

Neben der sehr langsam erfolgenden spontanen Zyklisierungsreaktion, welche bei der Entstehung der Alzheimer-Krankheit vernachlässigbar ist, wurde das humane Enzym Glutaminyl-Cyclase (hQC) als Katalysator der oben genannten Zyklisierungsreaktion von Aβ-Peptiden identifiziert (kcat = 2,2 ± 0,5 x 10-4 s-1; ca.

1 Molekül alle 12 Stunden) [3]. Die humane QC katalysiert in seiner physiologischen Reaktion die Bildung von Pyroglutamat (pGlu) an N-terminalen Glutaminen von hormonell wirkenden Peptiden (kcat = 24,8 s-1; ca. 25 Moleküle pro Sekunde) (Abb. 1A). Diese intramolekulare Zyklisierungsreaktion ist z. B. erforderlich zum Schutz vor Abbau durch Exopeptidasen oder zur Ausbildung einer funktionell aktiven Konformation für eine spezifische Bindung an Rezeptoren [4]. Interessanterweise haben Studien gezeigt, dass hQC die Pyroglutamatbildung von Aβ-Peptiden katalysiert und folglich eine bedeutende Rolle in der initialen Phase in der Alzheimer-Krankheit spielen könnte. Dies konnte nachgewiesen werden, indem eine Inhibierung der hQC zur drastischen Reduktion von modifizierten Aβ-Peptiden in einem transgenen Mausmodell geführt hat [5]. Zusammenfassend katalysiert hQC eine Reaktion ausgehend von zwei unterschiedlichen Substraten: eine physiologische Reaktion, in der N-terminale Glutamine von hormonbasierten Peptiden zyklisiert werden sowie eine pathophysiologische Reaktion, in der N-terminale Glutamate von Aß-Peptiden zyklisiert werden. Aufgrund der mittlerweile nachgewiesenen Beteiligung von hQC in der Entstehung der Alzheimer’schen Krankheit ist dieses Enzym ein validiertes “drug target“ für Medikamentenentwicklung zur Behandlung von Alzheimer.

Für die Aufklärung der Abläufe bei der Entstehung der Alzheimer-Krankheit auf molekularer Ebene im Detail, wird neben einer Vielzahl von biochemischen und biophysikalischen Methoden die Röntgenkristallographie verwendet. In der Röntgenkristallographie (hier speziell die Proteinkristallographie) liefern generierte Proteinkristalle ein charakteristisches Beugungsmuster, aus dem eine 3D-Elektronendichtekarte des untersuchten Proteins berechnet werden kann. Auf der Grundlage dieser Daten kann ein atomares Modell des Proteins erstellt werden. In der praktischen Anwendung zur Generierung von Proteinkristallen ist die Verwendung von hochreinen und in Reinstwasser gelösten Substanzen essentiell, da die Methode maßgeblich von der Reinheit und der Genauigkeit der Konzentration aller eingesetzten Agenzien abhängig ist. Das hier eingesetzte Reinstwasser (Sartorius, Arium pro VF, Abb. 2) zeichnet sich durch eine sehr geringe Endotoxinkonzentration von < 0,001 EU/ml, einem TOC Gehalt (total organic carbon = gesamter organisch gebundener Kohlenstoff) von bis zu < 2 ppb sowie einer Leitfähigkeit von 0,055 µS/cm (kompensiert auf 25 °C) aus, welche anzeigt, dass Verunreinigungen durch Ionen entfernt sind, was wiederum maßgeblich für den Prozess der Proteinkristallisation entscheidend ist [siehe auch 6]. Neben dem Ausschluss von Proteasen und einer geringen organisch gebundenen Kohlenstoffkonzentration ist eine Leitfähigkeit von 0,055 µS/cm (kompensiert auf 25 °C) essentiell, da eine Nichtpräsenz von Salzen und Ionen maßgeblich für den Prozess der Proteinkristallisation entscheidend ist. Diese Voraussetzungen zur Bildung von Proteinkristallen werden anhand des Beispiels der humanen Glutaminyl-Cyclase gezeigt, welche in den initialen Stadien der Alzheimer-Erkrankung mutmaßlich eine wichtige Rolle spielt. Das verwendete Reinstwasser wurde wie unter [7] beschrieben hergestellt.

Material und Methoden
Expression und Aufreinigung von humaner QC
Das Plasmid pGEX-6P-1 enthält das QPCT Gen, welches für eine am N-Terminus um 34 Aminosäuren verkürzte Variante der hQC codiert. Dieses wurde in den E.coli Expressionsstamm BL21 Star transformiert, die anschließende Kultivierung der Zellen erfolgte in einem komplexen Nährmedium in Anwesenheit von 100 μg / ml des Antibiotikums Carbenicillin als Selektionsmarker. Durch Zugabe von 100 µM IPTG wurde die Expression induziert und die Kulturen anschließend 60 Stunden bei 16 °C und 200 rpm geschüttelt.

Die geernteten Zellen wurden mittels eines Fluidizer aufgeschlossen und nachfolgend wurde die hQC mittels GST-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Anschließend wurde der Affinitätstag abgeschnitten und eine anionentauscher-chromatographische Trennung durchgeführt. Die Reinheit von hQC wurde mittels SDS-PAGE verifiziert.

Kristallisation
Innerhalb von sieben Tagen wurden die Proteinkristalle der hQC nach einem abgewandelten Protokoll in Anlehnung an [8] mittels der Methode der Gasphasendiffusion im hängenden Tropfen generiert. Vor der Datenaufnahme am Röntgendiffraktometer wurde der Proteinkristall kurz in eine Kryolösung getaucht und anschließend in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Datenaufnahme und Prozessierung
Die Aufnahme des Datensatzes erfolgte am Messplatz ID23-1 am Synchrotron der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (Frankreich). Die Prozessierung der Daten ist mit XDS (X-ray Detector Software) durchgeführt worden [9]. Die Bestimmung initialer Phasen erfolgte über Molecular Replacement (Programm PHENIX) unter Verwendung der hQC Struktur (Protein Data Bank Code: 2AFM). Die erhaltenen Datensätze wurden in mehreren Zyklen mittels der Programme PHENIX.refine und COOT verfeinert und überprüft [10, 11].

Ergebnisse
Zur Überprüfung der Qualität und der Funktionalität des Reinstwassers in der Proteinkristallographie wurden unterschiedliche Proteinkristallisationsansätze pipettiert, welche normales Leitungswasser (typischerweise 266 – 364 µS/cm für die Stadt Göttingen [12]) oder Reinstwasser (Sartorius, Arium pro VF) (Leitfähigkeit 0.055 µS/cm; kompensiert auf 25 °C) als Basis hatten. Das Ergebnis dieses Vergleichs zeigt (Abb. 3), dass nur Proteinkristalle in den Proteinkristallisationsansätzen gewachsen sind, die Reinstwasser als Basis enthielten, während in den anderen Ansätzen das Protein präzipitierte und keine Kristallbildung zu verzeichnen war. Der Grund dafür sind vermutlich diverse physikochemische, biochemische und biologische Faktoren [6], wie zum Beispiel eine stark erhöhte Ionenstärke oder eine Verunreinigungen mit Proteasen. Die zusätzlichen Ionen könnten z. B. eine Kristallisation des Enzyms durch ungünstige (bzw. undefinierte) Kristallisationsbedingungen verhindern, während Proteasen das Protein mit der Zeit abbauen würden.

Die gewachsenen Proteinkristalle der hQC weisen die Raumgruppe H32 auf mit den Zellkonstanten a = b = 119 Å und c = 333 Å sowie den Winkeln α = β = 90° und γ = 120°. Eine asymmetrische Einheit beinhaltet zwei hQC Moleküle. Die Struktur eines Monomers verfügt über eine “open sandwich“ Topologie und enthält ein zentrales sechssträngiges β-Faltblatt. Dieses β-Faltblatt ist umgeben von sechs bzw. zwei α-Helices auf entgegengesetzten Seiten und wird flankiert von zwei α-Helices an einer Kante des β-Faltblattes (Abb. 4). Das aktive Zentrum ist nahe der Proteinoberfläche lokalisiert und zugänglich für Wasser und Liganden über einen Kanal. Im aktiven Zentrum befindet sich ein katalytisches Zinkion, das über die hoch konservierten Reste Asp159, Glu202 und His330 tetraedrisch koordiniert ist. Die vierte Koordinationsstelle wird von einem Wassermolekül besetzt, welches als „Platzhalter“ dient und bei Substratbindung verdrängt wird. Anschließend besetzt das Substrat die vierte Koordinationsstelle, was den initialen Schritt des Reaktionszyklus darstellt.

Mit der hier vorgestellten und schon vorher beschriebenen Methode zur Kristallisation der humanen QC unter Nutzung von Reinstwasser konnte gezeigt werden, dass die Proteinkristalle sowie auch die Qualität der gemessenen Daten absolut reproduzierbar sind.

Diskussion
Die Methode der Proteinkristallographie erlaubt die Analyse von dreidimensionalen Proteinstrukturen auf atomarer Ebene. Im Fall der humanen QC können durch diese Methode detaillierte strukturelle Information über die Architektur des aktiven Zentrums der hQC gesammelt werden und somit Einblicke gewonnen werden, welche Rolle dieses Enzym in der Entstehung der Alzheimer-Erkrankung spielt. Mögliche zukünftige Schritte für dieses Projekt könnten eine Komplexierung des Enzyms mit physiologischen oder pathophysiologischen Substraten, z.B. mit Aβ-Peptiden, sein. Dadurch könnte man molekulare Einblicke in den Reaktionsmechanismus und den Bindungsmodus des Substrats erhalten. Fasst man die gesammelten Informationen zusammen, wäre der nächste Schritt die Entwicklung eines spezifischen pharmazeutischen Wirkstoffs als Inhibitor der hQC zur Therapie der Alzheimer-Krankheit.

Die Ergebnisse belegen, dass das Arium-Reinstwasser für die Proteinkristallographie geeignet ist und zu reproduzierbaren und gut definierten Proteinkristallen und Strukturmodellen (Abb. 3 und 4) verglichen mit Leitungswasser führt. Herkömmliches Leitungswasser ist nicht frei von biologischen und chemischen Kontaminationen und deren Zusammensetzung kann regional verschieden sein. Wie die Erfahrung zeigt, müssen aber alle verwendeten Lösungen, insbesondere das verwendete Reinstwasser, eine gleichbleibend hohe Qualität haben.

Das stets frisch entnommene Arium-Reinstwasser stellt eine ökonomische Alternative zum handelsüblichen Reinstwasser in Flaschen dar, welches in der Laborpraxis auch längere Zeit gelagert wird. Bekannt ist jedoch, dass dieses Wasser sowohl eine höhere Leitfähigkeit (z. B. von CO2 aus der Luft oder herauslösen von Natrium-Kationen aus dem Glas [13]) als auch einen höheren TOC-Wert besitzt (persönliche Erfahrung) und dessen Eignung insofern für die Proteinkristallisation als unwahrscheinlich zu bewerten ist. Daher sollte für diese Methode stets frisch produziertes Reinstwasser mit einer reproduzierbaren hohen Qualität verwendet werden. Welche Kontaminationen bzw. Faktoren des Wassers letztlich die Kristallisation ungünstig beeinflussen, müsste in weiterführenden Experimenten in Zukunft geklärt werden. 

Danksagung
Ein besonderer Dank der Autoren gilt Herrn Prof. Dr. K. Tittmann für die wissenschaftliche Konzeption und Betreuung der Arbeit, für die Durchsicht des Manuskriptes und für die konstruktive Diskussion zum Thema sowie Herrn Michael Tietzel für die Unterstützung beim Zustandekommen des Projektes.

Autoren
Oliver Kupski1, Elmar Herbig2
1Abteilung für Molekulare Enzymologie, Göttinger Zentrum für Molekulare Biowissenschaften, Georg-August-Universität Göttingen.
2Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG, Göttingen.

Literatur

  1. Alzheimer, Alois: Über eine eigenartige Erkrankung der Hirnrinde. Vortrag in der Versammlung Südwestdeutscher Irrenärzte in Tübingen am 3. Nov. 1906. Referiert (Eigenbericht) in: Allgemeine Zeitschrift für Psychiatrie und psychisch-gerichtliche Medizin 64. Bd. (1907) S. 146-148
  2. Hardy, J.A. & Higgins, G.A. “Alzheimer’s disease: the amyloid cascade hypothesis.” Science 256, 184–185 (1992)
  3. Seifert F. et al., Glutaminyl cyclases display significant catalytic proficiency for glutamyl substrates.” Biochemistry 48: 11831-11833 (2009)
  4. Van Coillie E. et al., Functional comparison of two human monocyte chemotactic protein-2 isoforms, role of the amino-terminal pyroglutamic acid and processing by CD26/dipeptidyl peptidase IV.” Biochemistry 37, 12672-12680 (1998)
  5. Schilling et al., “Glutaminyl cyclase inhibition attenuates pyroglutamate Aβ and Alzheimer's disease-like pathology”  Nature Medicine 14, 1106-1111 (2008)
  6. Wille G.  “Kristallisation von Proteinen” Institut für Biophysik, Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main (2015) adaptiert nach einer Praktikumsanleitung von T. Stubbs und C. Parthier des Instituts für Biotechnologie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
  7. Nitzki F., Herbig E.: In situ Hybridisierung – Die Bedeutung von Reinstwasser für RNA Technologien. GIT Labor-Fachzeitschrift 57. Jahrgang, 3, (2013)
  8. K. F. Huang et al. “Crystal structures of human glutaminyl cyclase, an enzyme responsible for protein N-terminal pyroglutamate formation”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102  pp. 13117–13122 (2005)
  9. Kabsch, W. “Xds.” Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography 66, 125–132 (2010)
  10. Adams, P D. et al., PHENIX: A Comprehensive Python-Based System for Macromolecular Structure Solution.” Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography 66, 213–221 (2010)
  11. Emsley, P. et al., Features and Development of Coot.” Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography 66, 486–501 (2010)
  12. Trinkwasser Analyse 2015 der Stadtwerke Göttingen AG

13. Iven, T. et. al., “Signalstoffe der pflanzlichen Abwehr – HPLC-MS/MS-Analyse von Jasmonaten“ LABO (2014)

Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/search/gitsearch/Alzheimer

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