Proteinogene Bausteine im Biofilm von Bacillus subtilis

Verfolgung struktureller Änderungen im Biofilm mittels NMR

  • Abb. 1: Kristallstruktur von TasA in vereinfachter Darstellung. Die Sekundärstrukturelemente, wie Helices und β-Stränge, sind in Rot und Grün, entsprechend, dargestellt. Die Bereiche der vorhandenen PPII-Helices sind in Pink hervorgehoben, wohingegen in grauer Farbe die Loops gezeigt sind. Nicht strukturell definierte Regionen sind als unterbrochene Linie markiert. Ein gebundenes Salicylat-Molekül (gelb), sowie Ethylenglykol-Moleküle (cyan) sind als Stäbchenmodell dargestellt mit rot markierten Sauerstoffatomen. Sie spielen keine Rolle für die Funktion von TasA und resultieren aus der, zur Kristallisation von TasA, benutzten Screenzusammensetzung.Abb. 1: Kristallstruktur von TasA in vereinfachter Darstellung. Die Sekundärstrukturelemente, wie Helices und β-Stränge, sind in Rot und Grün, entsprechend, dargestellt. Die Bereiche der vorhandenen PPII-Helices sind in Pink hervorgehoben, wohingegen in grauer Farbe die Loops gezeigt sind. Nicht strukturell definierte Regionen sind als unterbrochene Linie markiert. Ein gebundenes Salicylat-Molekül (gelb), sowie Ethylenglykol-Moleküle (cyan) sind als Stäbchenmodell dargestellt mit rot markierten Sauerstoffatomen. Sie spielen keine Rolle für die Funktion von TasA und resultieren aus der, zur Kristallisation von TasA, benutzten Screenzusammensetzung.
  • Abb. 1: Kristallstruktur von TasA in vereinfachter Darstellung. Die Sekundärstrukturelemente, wie Helices und β-Stränge, sind in Rot und Grün, entsprechend, dargestellt. Die Bereiche der vorhandenen PPII-Helices sind in Pink hervorgehoben, wohingegen in grauer Farbe die Loops gezeigt sind. Nicht strukturell definierte Regionen sind als unterbrochene Linie markiert. Ein gebundenes Salicylat-Molekül (gelb), sowie Ethylenglykol-Moleküle (cyan) sind als Stäbchenmodell dargestellt mit rot markierten Sauerstoffatomen. Sie spielen keine Rolle für die Funktion von TasA und resultieren aus der, zur Kristallisation von TasA, benutzten Screenzusammensetzung.
  • Abb. 2: Biofilmbildung auf der Oberfläche von flüssigem Medium. A1: Biofilm gebildet von Wildtyp B: subtilis; A2: die ΔtasA-Mutante zeigt keine Fähigkeit zur Biofilmbildung; B1: Kontrolle, B2: die ΔtasA-Mutante kann unter Zusatz von rekombinantem TasA wieder Biofilm bilden.

In enger Zusammenarbeit zwischen dem Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie (FMP) und dem Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) in Berlin-Buch sowie der Leibniz-Universität Hannover wird die Biofilmbildung auf molekularer Ebene untersucht. TasA, das wichtigste Protein des Biofilms von B. subtilis, wird als lösliches, gut gefaltetes Protein gebildet und erfährt während des Einbaus in stabilere, unlösliche Fibrillen einen Zuwachs von β-Struktureinheiten.

 

Biofilme sind in der Natur weit verbreitet und begegnen uns u. a. unter feuchten Bedingungen auf Oberflächen als schleimige Schichten. Nähere Untersuchungen haben gezeigt, dass Biofilme von Mikroorganismen zum eigenen Schutz gebildet werden. Dabei werden basierend auf chemischer Kommunikation der Zellen (Quorum sensing) [1] Polysaccharide, DNA und Proteine von den Bakterien zeitgleich nach außen geschleust. Diese hochmolekularen Substanzen umgeben dann die Zellen als eine viskose Schicht, die wiederum als extrazelluläre Matrix (ECM) bezeichnet wird.

Wir Menschen sind von etwa ebenso vielen Bakterien besiedelt, wie wir Körperzellen besitzen [2]. Viele dieser Bakterien sind von Bedeutung für unsere gesunden Lebensfunktionen, andere können aber auch gesundheitliche Probleme wie Herzinnenhautentzündung, Mukoviszidose, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) oder Karies verursachen. Im Mund hatte jeder bereits Kontakt mit Biofilmen und ihrer mechanischen Resistenz. Aber auch auf Implantaten können sich unerwünschte, biofilmbildende Bakterien ansiedeln und Entzündungen hervorrufen. In vielen Fällen versagen dabei Antibiotika, da sie den Biofilm als Diffusionsbarriere nicht durchdringen können. Kenntnisse über die Biofilmbildung sowie strukturelle Information sind die Grundvoraussetzung, um wirksame Gegenmaßnahmen zu entwickeln. Daran besteht ein großes medizinisches, aber auch ökonomisches Interesse.
In diesem Zusammenhang wurde im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit die Biofilmbildung bei B. subtilis, einem nicht-pathogenen Bodenbakterium, aber nahem Verwandten des Milzbranderregers Bacillus anthracis untersucht.

Das wichtigste Protein in den Fibrillen dieses Biofilms stellt TasA dar [3]. TasA-Fibrillen werden über ein zweites Protein TapA an der Oberfläche der Zellen verankert [4].

 
 
Primärstruktur von TasA: Basis für Stabilität
Von den 20 proteinogenen Aminosäuren fehlen TasA zwei, Cystein und Arginin. Cysteinfreie Proteine sind in der Natur keine Seltenheit. Dass aber ein Protein auf Arginin verzichtet, stellt eine Besonderheit dar. Durchschnittlich bestehen Proteine zu 10 % aus dieser basischen, geladenen Aminosäure, was sogar doppelt so viel ist als die statistische Verteilung erwarten lässt. Vermutlich ist diese Arginin-Freiheit ein Schutz vor Proteasen, welche in der Nähe von Argininen die Polypeptidkette spalten. Das lösliche TasA und die resultierenden Fibrillen gewinnen somit an Stabilität und Lebenszeit. Eine Vielzahl extrazellulär hochaktiver Proteasen wird sowohl von B. subtilis als auch von anderen Mikroorganismen in großer Menge gebildet. Das bekannteste Beispiel ist die Protease Subtilisin, die biotechnologisch produziert und in der Waschmittelindustrie eingesetzt wird.
Mittels Sequenzvergleich (Blast search) wurde eine hohe Ähnlichkeit von TasA zu Camelysinen festgestellt, die ebenfalls weitgehend Arginin-freie Sequenzen besitzen. Camelysine sind Metall-abhängige Proteasen, die von verschiedenen pathogenen Bacillus-Arten wie B. anthracis gebildet werden. Für TasA selbst konnte jedoch keinerlei proteolytische Aktivität nachwiesen werden und auch keine Bindung zweiwertiger Metallionen. Möglicherweise ist TasA durch den Verlust der Metallbindungsstelle evolutionär aus einer Protease hervorgegangen. Es wird vermutet, dass es einen Zusammenhang zwischen der Pathogenität eines Bacillus-Stammes und der enzymatischen Aktivität der TasA-Homologen wie der Protease Camelysin gibt.
 
3D-Struktur von TasA: starr und flexibel zugleich
Die ersten Kristallisationsversuche mit dem rekombinanten reifen TasA schlugen fehl, da der C-Terminus entsprechend der Vorhersage der Sekundärstruktur mit Jpred [5] als sehr flexibel eingeschätzt wurde. Erst mit Hilfe eines C-terminal um 22 Aminosäuren verkürzten Konstrukts wurde eine kristallisationsfähige Proteinpräparation erhalten. Somit gelang das Lösen der Kristallstruktur von TasA (Abb. 1). Dies war für viele bisher beschriebene funktionelle, Fibrillen-bildende Proteine nicht möglich, da sie üblicherweise unstrukturiert sind, bevor sie sich zu Fibrillen zusammenlagern. Bei TasA ist das nicht der Fall. Die lösliche, vorfibrilläre Struktur besitzt einen sogenannten „Jellyroll“-Faltungstyp (ähnlich einer Biscuitrolle), dessen zwei antiparallele β-Faltblätter durch kurze α-Helices und Loops (unstrukturierte Bereiche) verbunden sind. Aber die Struktur hat noch weitere Besonderheiten zu bieten. Zwei Regionen konnten als Polyprolin-Helices (PPII) identifiziert werden (Abb. 1). Diese Strukturelemente fungieren oft als Schalter für strukturelle Änderungen, da nur wenig Energie für die Konformationsänderung in α-Helices oder β-Stränge nötig ist. Kürzlich wurde festgestellt, dass die PPII-Helices in Spidroin, dem Protein der Spinnenseide, eine sehr essentielle Rolle für die Ausbildung und Festigkeit von Spinnennetzen spielt [6].
 
Kernmagnetresonanzspektroskopie (NMR): Monitoring von TasA im Biofilm
Ein Zuwachs an β-Strängen ist charakteristisch bei der Ausbildung von Fibrillen aus unstrukturierten Vorformen oder, wie bei TasA, aus strukturierten Proteinen. Letzteres konnte mittels NMR unter Einsatz von 2H13C15N-markiertem TasA nachgewiesen werden.
Dazu wurde TasA in E. coli mit der o. g. Markierung hergestellt und gereinigt. Einer B. subtilis ΔtasA-Mutante, die nicht mehr in der Lage ist, Biofilm zu bilden, wurde dieses 2H13C15N-markierte TasA zudosiert. Der so wieder entstandene Biofilm (Abb. 2) konnte mittels Festkörper-NMR (ssNMR) untersucht werden. Das aufgezeichnete NMR-Spektrum des Biofilms wurde mit dem des löslichen Proteins verglichen, wobei ein Zuwachs an Signalen im spektralen Bereich für β-Strukturelemente nachgewiesen wurde.
 
Das TasA-Chamäleon: ein wechselhaftes Protein
Rekombinant in E. coli hergestelltes und gereinigtes TasA bildet bei der Aufkonzentrierung über 30 mg/ml bei neutralem pH-Wert Fibrillen, deren ssNMR-Spektrum dem des Biofilms sehr ähnelt. Geringer konzentrierte TasA-Präparationen gehen bereits nach wenigen Tagen bei neutralem pH-Wert in einen geleeartigen Zustand über, wohingegen bei saurem pH-Wert in vitro überwiegend Fibrillen gebildet werden. Der saure pH-Wert ist jedoch nicht typisch für das Wachstum von Bacilli. Er steht hier für positive Ladungen auf der Zelloberfläche, wie sie bereits 1963 von Weiss beschrieben wurden und ihre Ursache in sulfatierten Exopolysacchariden haben könnte [7]. Möglicherweise besteht eine Koexistenz des geleeartigen Zustands von TasA, um eine gewisse Viskosität im Umfeld der Bakterien zu erzeugen und den TasA-Fibrillen, die dem Biofilm seine Stabilität geben.
 
Ausblick
Für das vollständige Verstehen der Eigenschaften eines Biofilms ist, neben der Analyse seiner Komponenten, auch die Untersuchung ihres Zusammenspiels wichtig. Hier ist vor allem die Wechselwirkung mit TapA, dem zweiten Protein in den Fibrillen, aber auch mit den Exopolysacchariden zu erforschen. Dabei werden wieder die NMR-Methoden Anwendung finden, die durch kryo-elektronenmikroskopische Untersuchen der Fibrillen ergänzt werden.
 
 
​Autoren
Anne Diehl1, Yvette Roske2, Hartmut Oschkinat1
 
Zugehörigkeit
1Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie, Berlin, Deutschland
2Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin, Deutschland
 

Kontakt   
Prof. Hartmut Oschkinat
Leibniz-Forschungsinstitut für
Molekulare Pharmakologie
Berlin, Deutschland
oschkinat@fmp-berlin.de

 

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Referenzen:

[1] Dogsa I, Choudhary KS, Marsetic Z, Hudaiberdiev S, Vera R, Pongor S, Mandic-Mulec I. ComQXPA quorum sensing systems may not be unique to Bacillus subtilis: a census in prokaryotic genomes. PLoS One 9 (5): e96122 (2014).

[2] Sender R., Fuchs S., Milo R. (2016) Revised Estimates for the Number of Human and Bacteria Cells in the Body. PLoS Biol. 14: e1002533 (2016).

[3] Chai, L., Romero D., Kayatekin C., Akabayov B., Vlamakis H., Losick R., Kolter R., Isolation, characterization, and aggregation of a structured bacterial matrix precursor. J. Biol. Chem. 288, 17559–68 (2013).

[4] Romero D., Vlamaki, H., Losick R. & Kolter R., Functional analysis of the accessory protein TapA in Bacillus subtilis amyloid fiber assembly. J. Bacteriol. 196, 1505–13 (2014).

[5] Drozdetskiy A., Cole C., Procter J. & Barton G. J., JPred4: a protein secondary structure prediction server. Nucl. Acids Res. 43, 389–394 (2015).

[6] Oktaviani N.A., Matsugami A., Malay A.D., Hayashi F., Kaplan D.L., Numata K., Conformation and dynamics of soluble repetitive domain elucidates the initial β-sheet formation of spider silkNature Communications, 9, 2121-2131 (2018).

[7] Weiss L., The pH value at the surface of Bacillus subtilis. J. Gen. Microbiol. 32, 331–340 (1963).

Originalveröffentlichung:

Diehl A., Roske Y., Ball L., Chowdhury A., Hiller M., Molière N., Kramer R., Stöppler D., Worth C.L., Schlegel B., Leidert M., Cremer N., Erdmann N., Lopez D., Stephanowitz H., Krause E., van Rossum B.J., Schmieder P., Heinemann U., Turgay K., Akbey Ü., Oschkinat H., Structural changes of TasA in biofilm formation of Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 115, 3237-3242 (2018).

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Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie


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