Quantitative Bildzytometrie

Was man beachten sollte

  • Abb. 1: Die Abbildung zeigt eine Fluoreszenzaufnahme am iCys (CompuCyte Corp.) einer Zellkultur (Lungenepithel) mit Kernfärbung links und einer Antikörperfärbung eines Oberflächenrezeptors rechts. Obwohl die Zellen auf dem gesamten Blickfeld verteilt sind, ist bei der Oberflächenfärbung zu erkennen, dass die obere rechte Ecke deutlich dunkler ist, als der restliche Bereich. Da der Rezeptor auf sämtlichen Zellen in gleicher Menge vorhanden ist, ist dieser Unterschied (bei optimal eingestelltem Gerät) auf eine ungleichmäßige Färbung zurückzuführen. Dies kann Messdaten verfälschen. Eine Titration der Antikörper ist hilfreich. Problematisch sind auch Bereiche mit sehr dichten, sich überlagernden Zellen (unten rechts), da diese meist nur schwer voneinander zu unterscheiden sind und sich zudem der Hintergrund erhöht.Abb. 1: Die Abbildung zeigt eine Fluoreszenzaufnahme am iCys (CompuCyte Corp.) einer Zellkultur (Lungenepithel) mit Kernfärbung links und einer Antikörperfärbung eines Oberflächenrezeptors rechts. Obwohl die Zellen auf dem gesamten Blickfeld verteilt sind, ist bei der Oberflächenfärbung zu erkennen, dass die obere rechte Ecke deutlich dunkler ist, als der restliche Bereich. Da der Rezeptor auf sämtlichen Zellen in gleicher Menge vorhanden ist, ist dieser Unterschied (bei optimal eingestelltem Gerät) auf eine ungleichmäßige Färbung zurückzuführen. Dies kann Messdaten verfälschen. Eine Titration der Antikörper ist hilfreich. Problematisch sind auch Bereiche mit sehr dichten, sich überlagernden Zellen (unten rechts), da diese meist nur schwer voneinander zu unterscheiden sind und sich zudem der Hintergrund erhöht.
  • Abb. 1: Die Abbildung zeigt eine Fluoreszenzaufnahme am iCys (CompuCyte Corp.) einer Zellkultur (Lungenepithel) mit Kernfärbung links und einer Antikörperfärbung eines Oberflächenrezeptors rechts. Obwohl die Zellen auf dem gesamten Blickfeld verteilt sind, ist bei der Oberflächenfärbung zu erkennen, dass die obere rechte Ecke deutlich dunkler ist, als der restliche Bereich. Da der Rezeptor auf sämtlichen Zellen in gleicher Menge vorhanden ist, ist dieser Unterschied (bei optimal eingestelltem Gerät) auf eine ungleichmäßige Färbung zurückzuführen. Dies kann Messdaten verfälschen. Eine Titration der Antikörper ist hilfreich. Problematisch sind auch Bereiche mit sehr dichten, sich überlagernden Zellen (unten rechts), da diese meist nur schwer voneinander zu unterscheiden sind und sich zudem der Hintergrund erhöht.
  • Tab1.PNG
  • Abb. 2: Eine Negativkontrolle gehört nicht nur bei der Analyse von Geweben (links: analysierter Schnitt einer Synovialmembran mit Positionsangabe auf dem Objektträger) zur Standardprozedur. Gewöhnlich wird eine Isotypenkontrolle verwendet (oben), obwohl auch andere Kontrollen denkbar sind. Anhand dieser Kontrollprobe kann der Schwellwert (gestrichelte Linie) festgelegt werden. Bei der quantitativen Analyse der Messdaten lassen sich damit in den Intensitätshistogrammen auch markierte Zellen identifizieren, die nicht ohne weiteres als eigenständige Population zu erkennen sind, wie z. B. Aktivierungsmarker.

Die Mikroskopie ist wesentlicher Bestandteil vieler wissenschaftlicher Bereiche. Will man Sachen auf den Grund gehen, kommt man meist nicht darum herum, sie sich groß und in Farbe anzusehen. Die Spanne reicht dabei von Ganzkörperanalysen über Gewebe und einzelnen Zellen bis hin zu intrazellulären Bestandteilen. Die Entwicklung der Fluoreszenzmikroskopie und die Möglichkeit einzelne Zellen und Zellbestandteile spezifisch anzufärben war dabei verständlicherweise äußerst hilfreich.

Während früher lediglich aufgrund von Autofluoreszenz bestimmte Zellbestandteile, z. B. Chlorophyll oder Kollagen, zu erkennen waren, lassen sich mittlerweile durch hochspezifische Antikörper oder DNA-Sonden selbst kleinste Bestandteile ins Blickfeld des Forschers holen. Allerdings muss dabei auch so einiges beachtet werden. Unterscheiden sollte man schon nach dem Zweck der mikroskopischen Aufnahme. Geht es um Verständnisfragen, z. B. Verteilungen bestimmter Zellen im Gewebe, die räumliche Architektur zellulärer Bestandteile oder das Wissen um das einfache Vorhandensein bestimmter Eigenschaftsausprägungen von Zellen, dann steht im Allgemeinen ein „schönes Bild“ im Vordergrund. Schließlich soll der Betrachter genau das erkennen, was beabsichtigt ist.

Quantitative Analyse
Ist das Ziel allerdings eine quantitative Bestimmung von Zellen im Gewebe oder intrazellulärer Bestandteile, so sollte man sich an einige Grundregeln halten. Daten zählen dann mehr als ein optisch ansprechendes Bild. Zweifelsohne sollte auch hier auf Fokus, Kontrast, Belichtung, etc. geachtet werden, die gewonnenen Erkenntnisse sollten aber vertrauenswürdig und reproduzierbar sein und nicht auf bestimmte Aufnahmemodalitäten zurückzuführen sein. Soll zum Beispiel der DNA-Gehalt von Zellen bestimmt und eventuell auch noch mit anderen Experimenten verglichen werden, so ist es natürlich wichtig, Vergleichbarkeit herzustellen.

Konstante Einstellungen
Sämtliche Einstellungen, Anregungslicht, Filterkonfiguration, Belichtungszeit, Blende, etc., müssen identisch gewählt werden, auch wenn man den Kontrast, die Helligkeit oder sonstiges durch ein paar kleine Änderungen noch verbessern könnte.

Schließlich lässt die Helligkeit der Fluoreszenz auf die Anzahl der gebundenen Farbstoffmoleküle schließen. Ändert sich jetzt die Intensität des Fluoreszenzsignals aufgrund veränderter Einstellungen, lässt sich zwar diese Aufnahme analysieren, ein Vergleich mit anderen Aufnahmen ist allerdings ausgeschlossen. Es wäre schlichtweg als Fälschung der Daten anzusehen, wenn man behaupten würde, dass die Zellen aus Experiment A einen geringeren DNA-Gehalt haben als die Zellen aus Experiment B mit einer längeren Belichtungszeit.

Es versteht sich von selbst, dass zur quantitativen Analyse die Rohdaten und nicht nachträglich bearbeitete Bilder verwendet werden. Eine nachträgliche Bearbeitung ist zwar legitim (zur besseren Herausstellung der gewünschten Informationen), es wird aber bei Veröffentlichungen gefordert die Veränderungen als Zusatzinformationen bereitzustellen.

Konstante Beleuchtung
Wichtig für die Vergleichbarkeit von Ergebnissen ist auch eine stabile Anregungslichtquelle. Braucht die Lampe eine gewisse Vorlaufzeit um auf Betriebstemperatur (und somit eine bestimmte Helligkeit) zu kommen, sollte man diese auch unbedingt abwarten. Auch sind Schwankungen in der Intensität ein kritischer Punkt bei der quantitativen Analyse von Fluoreszenzdaten. Wird der Farbstoff mit einer geringeren Intensität angeregt, so ist auch das emittierte Licht entsprechend geringer.

Laser sind in dieser Hinsicht als stabiler anzusehen als Lampen (Quecksilberdampflampen oder Xenonlampen), obwohl auch diese in modernen Mikroskopen über einen Korrektionsmechanismus verfügen. Ob die Stabilität der Lichtintensität anhand von Softwarelösungen realisiert wird oder direkt an der Lampe, spielt dabei keine Rolle. Aufgrund einer hohen Leistung und Helligkeit werden allerdings sowohl Lampen als auch Laser immer mehr durch Dioden verdrängt (Wessels et al., 2012).

Eine homogene Ausleuchtung des aufzunehmenden Bereichs ist ebenfalls essentiell. Auch hier sollte es unerheblich sein, wo sich eine Zelle auf dem Bild befindet. Während die Mitte des Bildes meist recht gut ausgeleuchtet ist, kann es am Rand zu Abdunkelungen oder Unschärfe kommen. Dafür kann die Qualität der Kamera, des Objektives, aber auch ein schlecht eingestelltes Mikroskop verantwortlich sein. Auf jeden Fall sollte es bei quantitativen Fluoreszenzanalysen vermieden werden. Liegen beispielsweise Zellen mit abnormalem DNA-Gehalt immer in der Mitte oder am Rand des Bildes, sollte man sich dringend über eine Korrektur der Ausleuchtung des Mikroskops Gedanken machen.

Kontrolle
Die Kontrolle des einwandfreien Zustands des Mikroskops sollte sowieso zur Standardprozedur gehören. Schließlich wird die Fluoreszenzintensität auch durch altersbedingte Eintrübungen oder Verschmutzungen von Linsen oder Filtern beeinträchtigt. Eine Qualitätskontrolle des Gerätes ist in der durchflusszytometrischen Analyse mit fluoreszierenden Beads längst Standard. Dies sollte sich auch in der Bildzytometrie mit Hilfe von fluoreszierenden Objektträgern oder Beads konstanter Helligkeit durchsetzen. Andernfalls sind vergleichende Experimente über einen längeren Zeitraum, auch am gleichen Gerät, kaum vertrauenswürdig (Mittag et al., 2008a, 2008b).

Schärfe
Die Fluoreszenzintensität des gefärbten Präparates variiert ebenfalls mit der Fokusschärfe. Während die Intensität im Fokus am höchsten ist, verringert sie sich oberhalb und unterhalb dessen. Arbeitet man also im nicht-konfokalen Bereich, so sollte man, vor allem bei kleinen Objekten, auf den Fokus achten, obwohl dieser Effekt erst im deutlich unscharfen Bereich relevante Auswirkungen hat. Genaugenommen gilt das auch für Fluoreszenzanalysen unterschiedlicher Wellenlängen mit nicht oder nur unvollständig wellenlängenkorrigierten Objektiven. Aufgrund der unterschiedlichen Lichtbrechung müsste bei unterschiedlichen Fluoreszenzbereichen ein minimal anderer Fokus verwendet werden. Die Dicke des Präparates bzw. Schwankungen derer (und somit des Fokus), sowie eventuelle Faltenbildung oder Überlappungen und die daraus resultierende erhöhte Hintergrundhelligkeit muss ebenfalls bei der Auswertung berücksichtigt werden.

Fluoreszenz
Eine erhöhte Hintergrundfluoreszenz kann natürlich auch durch Färbeartefakte (Kristalle, Luftblasen, etc.) entstehen. Es sollte also bereits während der Probenvorbereitung und -präparation auf eine spätere optimale Analyse hingearbeitet werden. Eine gleichmäßige Verteilung einer ausreichenden Menge Farbstoffs bzw. Antikörper o. ä. sollte gewährleistet sein, sodass die gewünschten Zellen oder Zellbestandteile überall im Gewebe und in gleicher Intensität angefärbt werden können. Wiederholte Waschschritte können dahingegen die Menge an nicht gebundenem aber am Gewebe hängenden Farbstoffs und somit die Intensität des unspezifischen Hintergrundsignals deutlich senken.

Die Autofluoreszenz des Gewebes oder auch einzelner Zellen lässt sich da schon schwieriger reduzieren. Eine Kontrollprobe (ungefärbt, Isotypen- oder Sekundärantikörperkontrolle) sollte hier auf alle Fälle mit analysiert werden, sodass die Intensität des Hintergrundleuchtens, d.h. der Autofluoreszenz von Gewebe und Zellen sowie von Signalen resultierend aus klebenden oder unspezifisch bindenden Stoffen aus der Präparation ermittelt werden kann.

Da unterschiedliche Bereiche des zu analysierenden Gewebes bereits eine unterschiedliche „Ausgangsfluoreszenz“ aufweisen können (verursacht durch z. B. Kollagen oder einen unterschiedlichen Zellmetabolismus), sollte man bei der quantitativen Analyse von einzelnen Zellen im Gewebe dieses die Zelle umgebende Hintergrundleuchten mit der Gesamthelligkeit (also der spezifischen Fluoreszenz der Zelle plus der darunter und / oder darüber liegenden Autofluoreszenz) verrechnen. Ein einzelner Schwellwert, der Autofluoreszenz von spezifischer Färbung trennt, wird allerdings meist für die automatische Erkennung von Zellen genutzt, welcher wiederum anhand einer Negativkontrolle festgelegt werden sollte. Dieser Schwellwert bestimmt maßgeblich die Analyse und sollte deshalb sorgfältig gesetzt werden. Dies ist nicht nur bei einer quantitativen Gewebsanalyse wichtig, sondern beispielsweise auch bei einer 3D-Rekonstruktion isolierter Fluoreszenzdaten (anhand des Schwellwertes) konfokaler Aufnahmen.

Eine Kompensation, d.h. eine Verrechnung bzw. Eliminierung von ungewünschten Fluoreszenzsignalen („Spillover“ anderer Fluoreszenzfarbstoffe in den aufzunehmenden Fluoreszenzbereich) sollte bei der Analyse von mehrfach gefärbtem Gewebe ebenfalls gegeben sein. Lässt sich ein Spillover aufgrund einer geschickten Farbstoffkombination nicht vermeiden, so muss anhand geeigneter Kontrollen die Intensität des störenden Fluoreszenzlichtes im Analysekanal bestimmt und verrechnet werden. Es wäre schließlich sehr störend, wenn alle Zellen, die Marker A tragen, eine höhere Expression für Marker B zeigen würden, nur weil sich der Fluoreszenzfarbstoff A auch im Kanal B bemerkbar macht. Die Kompensation von Fluoreszenzsignalen gilt sowohl für monochrome als auch Farbkameras.

Analysebereich
Ein weiterer wichtiger Punkt bei der Analyse von Gewebe ist die Auswahl des zu analysierenden Bereichs. Optimal wäre natürlich das komplette vorhandene Gewebestück (z. B. Biopsie) zu untersuchen, dass das nicht immer möglich ist (z. B. bei kompletten Organen) dürfte jedem klar sein. Wichtig ist aber eine objektive und repräsentative Auswahl des Analysebereichs bzw. der Analysebereiche. Um wirklich zu einer objektiven Aussage über z. B. die Verteilung von Zellen oder deren Expression im Gewebe zu kommen, sollte eine ausreichend große Anzahl an Bildern willkürlich über das Gewebestück bzw. den relevanten Bereich verteilt sein. Sucht man sich für die Analyse vorher Bereiche aus, in denen die entsprechenden Zellen gehäuft auftreten bzw. genau das vorhanden ist, was gewünscht wird und zieht daraus Schlüsse auf das gesamte Gewebe, kann die Analyse nicht gut werden. Die willkürliche Auswahl einzelner Bereiche ist eigentlich nur zulässig, wenn damit bestimmte Sachverhalte dokumentiert werden sollen, keinesfalls aber für eine repräsentative Analyse des Gewebes. Fazit Um so manchem geplagten Doktoranden die Arbeit zu erleichtern, der tagelang am Mikroskop Zellen ausgezählt hat, gibt es mittlerweile Systeme, die Präparate auf Objektträgern gleich stapelweise hintereinander und in mehreren Fluoreszenzkanälen einscannen, sodass die Analyse des Gewebes dann offline (am virtuellen Objektträger) und meist auch, je nach Anwendung, (semi-) automatisch erfolgen kann. Auch die zunehmende Entwicklung auf dem Gebiet der Einzelzellverfolgung erspart so manche Stunde am Bildschirm. Zwar erleichtert jede Automation die Arbeit, man sollte aber nicht blind den ausgespuckten Ergebnissen vertrauen. Man sollte sich stets darüber im Klaren sein, was wie und auf welche Art und Weise ausgewertet wird und falls nötig korrigierend eingreifen. Dabei muss aber Objektivität, Glaubwürdigkeit und Wiederholbarkeit der Ergebnisse gewährleistet bleiben.

Für weiterführende Informationen zum Thema Bildzytometrie und Standardisierung von Fluoreszenzanalysen verweisen wir den interessierten Leser an die Zeitschrift Cytometry Part A (http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/%28ISSN%291552-4930)

Literatur
[1] Mittag A. et al.: In Cellular Diagnostics:Basic Principles, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry, U. Sack, A. Tarnok, and G. Rothe, eds. (Basel: S. Karger AG (Switzerland)), pp. 89–106. (2008a).
[2] Mittag A. et al.: In Cellular Diagnostics: Basic Principles, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry, U. Sack, A. Tarnok, and G. Rothe, eds. (Basel: S. Karger AG (Switzerland)), pp. 159–177. (2008b)
[3] Wessels J.T. et al.: F.S. A 81, 188–197 (2012)

 

Autor(en)

Kontaktieren

Universitätsklinikum Leipzig AöR
Liebigstraße 18
04103 Leipzig
Telefon: +49 341 9710 9
Telefax: +49 341 9715905

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.