Rasterkraftmikroskopie in der Analytik von Biomolekülen

An der Grenzfläche zwischen optischer Mikroskopie und Röntgenkristallographie

  • Abb. 1: Schema des AFM AufbausAbb. 1: Schema des AFM Aufbaus
  • Abb. 1: Schema des AFM Aufbaus
  • Abb. 2: Schematische Darstellung einer AFM-Kraft-Abstandskurve induziert durch Annäherung an und anschließendes Entfernen der AFM-Sonde von der Probenoberfläche (Pfeile). Die Biegung des AFM-Hebelarms aufgrund von Wechselwirkungen mit Molekülen auf der Oberfläche wird jeweils angedeutet. Die Kraftauslenkung des Hebelarms beim Reißen der Bindungen zwischen Sonde und Oberfläche zeigt die Bindungskraft an.
  • Abb. 3: AFM-Topographiebilder von Protein-Komplexen in 3D-Darstellung (A) und Aufsicht (B-D). Die Abbildungen zeigen die Elongation von Proteinkonformationen (B [2]), strukturelle Heterogenität einer Probe (hier in (C) aufgrund einer flexiblen Linkerstruktur in den Proteinen [3]) oder die gegenseitigen Einflüsse von Proteinbindung und DNA-Superstruktur aufeinander (D [4]).

Die Rasterkraftmikroskopie (englisch: atomic force microscopy, AFM) ist ein Vertreter der Familie der Rastersonden-Mikroskopien, in denen eine mechanische Mess-Sonde über die Oberfläche einer zu untersuchenden Probe bewegt wird. In diesem Artikel wird das Potential der Methode für die Analytik von Biomolekülen erläutert.

Das erste Rastersonden-Mikroskop, das Rastertunnel-Mikroskop (englisch: scanning tunneling microscope, STM), auf dem alle anderen Mitglieder dieser Familie basieren, wurde 1981 von Gerd Binnig und Heinrich Rohrer entwickelt, wofür sie 1986 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet wurden. Das Mess-Prinzip des STM beruht auf der Detektion eines Tunnelstroms zwischen der Mess-Sonde und der Probenoberfläche bei ausreichend kleinem Abstand zwischen Sonde und Probe. Analog dazu werden mit dem Rasterkraftmikroskop (englisch: atomic force microscope, AFM), das 1986 durch Gerd Binnig, Calvin Quate und Christoph Gerber erstmals realisiert wurde, atomare Wechselwirkungskräfte zwischen Mess-Sonde und Probe gemessen. In den meisten biologischen Anwendungen der Rasterkraftmikroskopie sind die detektierten Wechselwirkungen aus mehreren verschiedenen, abstoßenden sowie anziehenden nicht-kovalenten Bindungen zusammengesetzt. Gerade für die Abbildung biologischer Proben bietet dieser Ansatz den Vorteil, dass die Probenoberflächen keine elektrische Leitfähigkeit aufweisen müssen (im Unterschied zu STM) und auch ansonsten keiner besonderen Modifikationen bedürfen.

AFM-Technik
In der Biologie wird AFM zur strukturellen Studie von Biomolekülen und der analytischen Untersuchung ihrer Wechselwirkungen eingesetzt. Hierbei existieren zwei unterschiedliche Anwendungen der Methodik: Kraftspektroskopie und Oberflächen-Abbildungen. Beide Anwendungen beruhen auf dem gleichen Mess-Prinzip: Wechselwirkungskräfte zwischen AFM-Mess-Sonde und Probenoberfläche werden anhand der Auslenkung eines Hebelarms gemessen, an dessen unterem Ende die Mess-Sonde angebracht ist (Abbildung 1). Das Material (typischerweise Silizium oder Silizium-Nitrid) und die genaue Geometrie des Hebelarms bestimmen seine Elastizität und damit seine Federkonstante, die gemäß dem Hooke‘schen Gesetz den Umrechnungsfaktor zwischen der Armauslenkung und der korrelierenden Kraft angibt.

In den handelsüblichen AFM-Systemen wird die Hebelarm-Auslenkung durch ein optisches System anhand der Ablenkung eines vom Hebelarm reflektierten Laserstrahls auf einem Photodetektor registriert (Abb. 1). Anziehende Wechselwirkungen zwischen Sonde und Probe führen hierbei zur Auslenkung des Hebelarms hin zur Oberfläche, während abstoßende Wechselwirkungen (z.B. aufgrund erhöhter Oberflächenstrukturen) den Hebelarm von der Oberfläche wegbiegen. Mittels Piezo-Präzisions-Positionssystemen kann die Probe pixel- und zeilenweise translatiert werden. Abbildungen können erzielt werden, indem die Sonde dabei direkt der Probenoberfläche folgt, ähnlich einer Grammophon-Nadel, im sogenannten Kontakt-Modus. Alternativ wird der Hebelarm über der Probe oszilliert (Oszillations-Modus), so dass ein direkter Kontakt zwischen Sonde und Probe nur am untersten Punkt der Oszillations-Amplitude stattfindet, und um ein Vielfaches kürzer, sanfter, und damit schonender für die Probe ist.

AFM-Kraftspektroskopie
Die als Kraftspektroskopie bezeichnete Anwendung von AFM basiert auf der direkten mechanischen Manipulation intra- oder intermolekularer Bindungen und wird zur Messung von Wechselwirkungen zwischen Rezeptor-Liganden Paaren, zur energetischen Untersuchung von Proteinfaltung oder -entfaltung, oder zur Messung mechanischer Eigenschaften von Biopolymeren eingesetzt.

Für die Untersuchung intermolekularer Wechselwirkungen wird ein Interaktionspartner (z.B. ein Rezeptormolekül) an die Mess-Sonde und der zu untersuchende Interaktionspartner (der Ligand des Rezeptors) an die Substratoberfläche gebunden. Eine Übersicht über verschiedene Methoden, mit der Biomoleküle an Substratoberflächen stabil verankert werden können, findet sich zum Beispiel in [1]. Wird die Sonde in Kontakt mit der Substratoberfläche gebracht, bilden sich Bindungen zwischen den Partner-Molekülen aus, die beim Zurückziehen der Sonde genau bei der applizierten Kraft reißen, die ihrer Wechselwirkungsstärke entspricht und die aus dem entsprechenden Abstand von Sonde und Substratoberfläche abgelesen werden kann. Statistische Auswertungen der resultierenden sogenannten Kraft-Abstandskurven (Abb. 2) geben somit Einblicke in die intermolekularen Interaktionen. Für die Untersuchung von Proteinfaltungs- und Entfaltungsvorgängen oder der mechanischen Eigenschaften von Biopolymeren (z.B. DNA) werden einzelne Moleküle mit ihrem einen Ende an der Mess-Sonde und dem anderen an der Substratoberfläche chemisch verankert. Durch Annähern an und Zurückziehen der Sonde von der Oberfläche wird der eingespannte Molekülfaden entsprechend gedehnt oder entspannt. Aus der elastischen Antwort der Sonde können die mechanischen Eigenschaften des untersuchten Moleküls und das Reißen oder die Bildung intramolekularer Bindungen (in Protein-Entfaltungs- und Faltungsprozessen) abgelesen werden. Die gezielte Applikation von Kräften durch die Mess-Sonde auf eine Probe kann außerdem eingesetzt werden, um die Elastizität biologischer Membranen zu untersuchen.

Das breite, der AFM-Kraftspektroskopie zugängige Spektrum an Wechselwirkungskräften wird durch die mechanische Federkonstante der Sonde limitiert und liegt im Bereich von Piko- bis Mikro-Newton. Diese Kraftauflösung ermöglicht selbst die Auflösung einzelner Bindungen.

AFM-Abbildungen von Biomolekülen
In der abbildenden Anwendung von AFM werden an jeder Pixelposition und Zeile für Zeile die Oberflächeneigenschaften der Probe, beispielsweise die Probenhöhe, anhand der atomaren Wechselwirkungen mit der Mess-Sonde detektiert. Das Rasterkraftmikroskop erzeugt auf diese Weise ein Höhenprofil oder Topographiebild der Probe, dessen Auflösung hauptsächlich durch die Schärfe der Sonde limitiert ist. Das Auflösungsvermögen liegt im niedrigen Nanometer-Bereich und ermöglicht somit die Darstellung einzelner Moleküle.

Die resultierenden Abbildungen enthalten dreidimensionale Informationen über die Probenpartikel (Abb. 3A), da zu jedem lateralen Bildpunkt die Höheninformation gespeichert wird. Aus den Volumina der abgebildeten Partikel kann anhand einer empirisch etablierten Eichkurve ihr Molekulargewicht abgeschätzt werden, woraus sich beispielsweise der oligomere Zustand eines Proteins oder die Stöchiometrie eines Protein-Komplexes ableiten lässt. Abbildungen von Protein-Molekülen oder -Komplexen bieten außerdem strukturelle Informationen, wie beispielsweise über ihre Elongation (Abb. 3B) oder interne Flexibilität (Abb. 3C), sowie wichtige Aufschlüsse über ihre Wechselwirkungen (zum Beispiel Protein-DNA Wechselwirkungen, Abb. 3D).

AFM-Abbildungen erfordern weder die gesonderte Modifikation der Biomoleküle (wie z.B. Fluoreszenz-Markierung) noch eine aufwendige Probenvorbereitung. Geringe Volumina (wenige Mikroliter) niederkonzentrierter Probenlösung (mit Endkonzentration im nanomolaren Bereich) werden auf eine Substratoberfläche aufgebracht. Die Probenlösung sollte dabei idealerweise sehr rein sein, d.h. sie sollte nur genau definierte Komponenten (z.B. Spezies von Proteinen) enthalten, um eine Interpretation der topographischen Abbildung zu ermöglichen. Die Substratoberflächen sollten sehr eben, glatt und sauber sein, um möglichst wenig störenden Hintergrund in den topographischen Abbildungen zu erzeugen. Typische Substrate sind gereinigtes Glas oder Silizium und Glimmer. Abbildungen können entweder an getrockneten Proben durchgeführt werden oder direkt in Flüssigkeit, was die physiologischen Bedingungen bestmöglich widerspiegelt. Für Messungen in Luft werden die Proben direkt nach dem Auftrag der niederkonzentrierten Probenlösung mit gefiltertem, de-ionisiertem Wasser gespült, um nur lose an die Oberfläche angelagerte Partikel aus der Probe zu entfernen, und in einem Stickstoff-Strahl getrocknet. In den getrockneten Proben sind die Moleküle über längere Zeit (bis zu Tagen) stabil auf der Substratoberfläche fixiert. Für Messungen in Flüssigkeit muss die Substratoberfläche meist vor Proben-Auftrag chemisch funktionalisiert werden, um die Stabilität der Bindung der Probenpartikel an die Substratoberfläche zu erhöhen und damit ihre Fixierung zu gewährleisten.

Einzelmolekül-Auflösung
Das Auflösungsvermögen des AFM im Bereich einzelner biologischer Moleküle liegt genau an der Grenzfläche zwischen der optischen Mikroskopie und der Röntgenkristallographie. In der traditionellen optischen Mikroskopie wird die Auflösung weitgehend durch Diffraktion auf einige hundert Nanometer limitiert. Neue Entwicklungen in optischen Methoden (superresolution microscopy) erlauben wesentlich verbesserte Auflösungen, erfordern allerdings aufwendigere Probenvorbereitung oder Auswertung. Die Röntgenkristallographie liefert Proteinstrukturen mit Auflösungen im atomaren Bereich (0,1 nm), erfordert aber äußerst aufwendige Probenvorbereitung und ist nur für sehr homogene Molekül-Systeme möglich. AFM mit seiner Auflösung im Bereich weniger Nanometer, gekoppelt mit wenig aufwendiger Probenvorbereitung, seiner Eignung zur Darstellung heterogener Proben und seiner Anwendbarkeit in Flüssigkeiten stellt damit eine für die Untersuchung biologischer Systeme äußerst attraktive Plattform dar.

Die Fähigkeit der Einzelmolekül-Auflösung begründet einen eigenen Forschungszweig der Biophysik (single molecule biophysics), in dem zumeist mittels quantitativer Methoden biologische Prozesse anhand der Einzelsignale aller Komponenten einer Gesamtprobe zusammengesetzt werden. Die Auflösung des Verhaltens der einzelnen Moleküle eines Ensembles ermöglicht dabei Einblicke auch in kurzlebige oder seltene Zustände, die oft wesentliche Informationen zum Verständnis der zugrundeliegenden biologischen Mechanismen liefern können.

Literatur
[1] Tessmer I. et al.: Journal of Nanobiotechnology 11, 25 (2013)
[2] Szambowska A. et al.: Nucleic Acids Research 42, 2308-2319 (2014)
[3] Sander B. et al.: Acta Crystallographica D Biological Crystallography 69, 2050-2060 (2013)
[4] [4] Roth H.M. et al.: DNA Repair 11, 286-293 (2012)

Weitere Beiträge zum Thema: www.git-labor.de/category/tags/afm
Mehr Informationen zur Biophysik: www.git-labor.de/category/tags/biophysik

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