Real-time PCR Nachweis

Spezies-spezifische Quantifizierung probiotischer Bakterien Lebensmittel

  • © molekuul.be - Fotolia.com© molekuul.be - Fotolia.com

Die Verwendung probiotischer Bakterien in den Lebens- und Futtermitteln hat in den letzten Jahren drastisch zugenommen. Allein die Hersteller platzieren in immer kürzeren Abständen gesundheitsfördernde Produkte auf dem Markt, die zu einem gesünderen Lebensstil beitragen sollen und werbewirksam in Szene gesetzt werden. Stetig steigende Umsatzzahlen verdeutlichen die positive Tendenz seitens des Konsumenten sich mit beispielsweise probiotischen Milchprodukten gesundheitsbewusst zu ernähren.

Hierbei werden Probiotika eingesetzt, um zum Einen den Fermentationsprozess und damit die Joghurtherstellung einzuleiten und zum Anderen aufgrund ihrer positiven Eigenschaften. In anderen Bereichen der Lebensmittelindustrie werden Bakterien gezielt eingesetzt, um Oliven beziehungsweise Sauerkraut oder Rotkraut haltbar zu machen und ihren charakteristischen Geschmack zu verleihen. Ohne den gezielten Einsatz probiotischer Mikroorganismen wären viele Produkte des täglichen und nichttäglichen Gebrauchs nicht denkbar. Trotz des immensen Wissens des gezielten Einsatzes probiotischer Bakterien zur Herstellung von Lebensmitteln ist deren Einfluss auf die Vorgänge im Darmtrakt noch nicht ausreichend geklärt. Zu viele Parameter, wie Stress, die Mikroflora im Darm sowie eine ausgewogene Ernährung spielen eine wichtige Rolle, damit Probiotika antipathogene Eigenschaften entwickeln und positiv auf das Immunsystem wirken können. Man vermutet jedoch, dass bestimmte hier eingesetzte Bakterienstämme in bestimmten Mixturen, in ausreichender Menge und in lebender Form auch gesundheitsfördernde Eigenschaften auf den Menschen haben können. Beispielsweise hat der Einsatz probiotischer Bakterien in der Tierernährung enorm zugenommen, besonders seit die Länder der Europäischen Union einen dem Wachstum der Tiere förderlichen flächendeckenden Einsatz von Antibiotika verboten haben. In funktionellen Lebensmitteln wie den Milchprodukten werden schon seit langer Zeit Probiotika als Starterkulturen eingesetzt. Bislang wurden die Spezies der Genera Lactobacillus (L.) und Bifidobacterium (B.) mittels klassischer mikrobiologischer Methoden identifiziert (z.B. phänotypischer Vergleich mit Referenzstämmen, physiologische Testung mit API 50 CHL Streifen von Bio Mérieux oder mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion [PCR]).

Zur Isolation probiotischer Spezies mussten bislang verschiedene Selektionsmedien verwendet werden.

Somit war die tägliche Diagnostik probiotischer Bakterien stets zeit-, arbeits- und kostenintensiv. Auch die phänotypische spezies-spezifische Identifizierung war oft fehlerhaft. Hinzu kommt, dass noch immer keine Quantifizierungsmöglichkeit der verwendeten Bakterien zur Verfügung steht. Neben der Unbedenklichkeit der eingesetzten Bakterienstämme spielt auch die Effektivität jedes probiotischen Stammes, die eingesetzten Menge im Gemisch verschiedener anderer Bakterienstämme sowie deren Lebensfähigkeit eine entscheidende Rolle bei der Etablierung gesundheitsfördernder Eigenschaften. In den FAO/WHO-Richtlinien von 2001 steht, dass Probiotika "lebende Mikroorganismen sind, die, wenn sie in ausreichender Menge eingesetzt werden, eine gesundheitsfördernde Eigenschaft auf den Konsumenten haben".

Selbst diese Richtlinien haben nicht zur Etablierung einer schnellen molekularbiologischen Methode geführt, um die tägliche Diagnostik inklusive der Quantifizierung der Bakterien innerhalb eines Arbeitstages durchführen zu können. Somit kann die konventionelle PCR Detektionsmethode an dieser Stelle nicht angewandt werden, da zwar die Überprüfung der Qualität, nicht aber die Quantität des zu detektierenden Bakterienstammes möglich ist.

Ziel einer Promotionsarbeit war es eine real-time PCR Methode zu etablieren, um den Anforderungen der etablierten Richtlinien seitens der FAO/WHO und der Europäischen Union in Hinblick der schnellen spezies-spezifischen Identifizierung und Quantifizierung der verwendeten probiotischen Bakterien gerecht zu werden. Eine solche Methode war in der täglichen Diagnostik probiotischer Produkte längst überfällig.

Zur Etablierung einer spezies-spezifischen real-time PCR wurden verschiedene Target-Sequenzen getestet, wobei klassische Nukleotidsequenzen wie die 23S-5S rRNA aufgrund fehlender Spezies-Spezifität und Mehrfachamplifikationen verschiedener Spezies verworfen wurden. Bei der Verwendung anderer Targetgene wie beispielsweise dem Hitzeschockprotein (GroEL) oder dem Rekombinase A-Gen (recA) konnten verschiedene Spezies des Genus Lactobacillus gezielt mit Hilfe der real-time PCR Methode identifiziert und quantifiziert werden. Auf diese Weise ist es nun möglich L. acidophilus, L. brevis, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. fermentum, L. helveticus, L. johnsonii, sowie L. reuteri zu detektieren und die vorliegende Menge zu bestimmen.

Die Wahl der Primersequenzen wurde in Hinblick auf deren Annealing- und Schmelzbedingungen sowie deren Spezies-Spezifität getroffen, sodass auch während eines realtime PCR Laufes verschiedene Spezies identifiziert und deren eingesetzte Menge ermittelt werden kann.

Für die weit verbreitete und genutzte Spezies Bifidobacterium animalis subsp. lactis und Bifidobacterium bifidum konnte die ATPase Untereinheit des ATP-abhängigen clpC-Gens erfolgreich zur Etablierung spezies-spezifischer Primersequenzen genutzt werden. Mit Hilfe von DNA-Isolaten aus verschiedenen probiotischen Produkten (Joghurt und sonstigen Milchprodukten, Tabletten, Granulat, Tropfen, Tampons, etc.) und DNA-Isolaten aus Verdünnungsreihen des jeweiligen Referenzstammes wurden die real-time PCR Primer validiert und über die Sequenzierung des PCRAmplifikats das Ergebnis bestätigt.

Des Weiteren konnten mittels klassischer Isolation der Bakterien über Selektivmedien gezeigt werden, dass die eingesetzten Bakterienstämme lebensfähig sind. 

Anschließend wurden diese zusätzlich mit Hilfe des MALDI-TOF MS-, der Kolonie-PCR- und der API 50 CHL-Methode identifiziert. Im Übrigen wurde die ALDI-TOF MSMethode auch erfolgreich zur direkten, kulturunabhängigen Identifizierung probiotischer Bakterien in Tabletten, Kapseln, Granulat und speziellen probiotischen Tampons genutzt. Eine erfolgreiche Identifizierung der Bakterien konnte hier bereits nach 30 Minuten gezeigt werden. Unter Verwendung dieser Methode wären auch bakterielle Verunreinigungen schnell detektierbar; eine Vielzahl ribosomaler Proteinspektren verunreinigender
Bakterien sind schon jetzt in der MALDI-TOF MS-Datenbank verfügbar.

Innerhalb von nur sieben Stunden ist eine schnelle, eindeutige und kulturunabhängige Diagnostik probiotischer Spezies in Lebensmitteln, Pharmazeutika und anderen Produkten des täglichen und nichttäglichen Gebrauchs mit Hilfe der etablierten realtime PCR möglich. Diese Methode kann beispielweise
Seitens des Herstellers oder auch auf behördlicher Seite eingesetzt werden, um im Bereich Qualitätsmanagement und Qualitätssicherung den Ansprüchen und Inhaltsangaben gerecht zu werden. Diese Überprüfung dient zum einen der Einhaltung der FAO/WHO-Richtlinien und denen der Europäischen Union und zum anderen kann ermittelt werden, ob die richtige Spezies, sowie eine ausreichende Menge verwendet wird. Denn nur so kann eine eventuelle gesundheitsfördernde bakterielle Wirkung probiotischer Mikroorganismen in Lebensmitteln und anderen Produkten gewährleistet werden.

Danksagung

Das Projekt wurde vom Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (KF2267401MD9) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie gefördert und im Rahmen eines Promotionsprojekts am Fachbereich Veterinärmedizin am Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der FU Berlin in der Arbeitsgruppe von
Herrn Prof. Dr. Wieler bearbeitet. Des Weiteren wurde das Projekt seitens des Sonderforschungsbereichs 852 (SFB852/1) unterstützt.

Literatur
Herbel, S. R. et al.: J. Appl. Microbiol. 115(6): 1402-1410 (2013)  

Kontakt
Prof. Dr. Lothar H. Wieler

Freie Universität Berlin
Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen (WE07)
Berlin, Deutschland

Autor(en)

Kontaktieren

Freie Univers. Berlin - Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen (WE07)
Robert-von-Ostertag-Str. 7-13
14163 Berlin

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.