REM-Proben ohne Gold-Bedampfung

Alternative Präparationsmethoden nutzen innere Leitfähigkeit

  • Abb. 1: Links: Brennnessel-Blatt (Urtica dioica), frisch, ungetrocknet, ohne Metallbedampfung. Kombination von SE- und RE-Bild. Im eingefügten Materialkontrast- Bild des RE-Detektors erscheinen die mineralisierten Haare hell. Rechts: Die extrem anhänglichen Samen von Galium aparine (Kletten- Labkraut), mit mineralisierten Haken; unreife frische Probe.Abb. 1: Links: Brennnessel-Blatt (Urtica dioica), frisch, ungetrocknet, ohne Metallbedampfung. Kombination von SE- und RE-Bild. Im eingefügten Materialkontrast- Bild des RE-Detektors erscheinen die mineralisierten Haare hell. Rechts: Die extrem anhänglichen Samen von Galium aparine (Kletten- Labkraut), mit mineralisierten Haken; unreife frische Probe.
  • Abb. 1: Links: Brennnessel-Blatt (Urtica dioica), frisch, ungetrocknet, ohne Metallbedampfung. Kombination von SE- und RE-Bild. Im eingefügten Materialkontrast- Bild des RE-Detektors erscheinen die mineralisierten Haare hell. Rechts: Die extrem anhänglichen Samen von Galium aparine (Kletten- Labkraut), mit mineralisierten Haken; unreife frische Probe.
  • Abb. 2: Superhydrophobes Blatt von Xanthosoma robustum (“elephant ear”). Die frische Probe (a, b) schrumpft schnell im REM, während das Glycerin-infiltrierte Material (c) über Stunden stabil bleibt.
  • Abb. 3: Cryo-Probe eines Xanthosoma-Blattes, ohne Metallbedampfung. (a) Bei -120 °C ist die Leitfähigkeit zu gering und die Abbildung wird durch Aufladungen gestört; bei -80 °C ist die Leitfähigkeit ausreichend (b). (c) Gefrierbruch, bei -70 °C aufgenommen.
  • Abb. 4: Kiefern-Pollen, durch Einwirkung von HCl-Dampf leitfähig gemacht.

Biologische REM-Proben werden normalerweise mit einer dünnen Goldschicht bedampft, um störende Aufladungen bei der Abbildung zu vermeiden. Bei einigen Präparationsmethoden können die Proben eine leichte innere Leitfähigkeit behalten, die es erlaubt, auf die Metallbeschichtung zu verzichten. Das vereinfacht die Probenpräparation und bietet darüber hinaus neue Wege zur Untersuchung natürlicher, unbedeckter Oberflächen, zum Beispiel für Materialkontrast-Abbildung oder zur Untersuchung von Adhäsionseffekten.

In konventionellen (Hochvakuum-) Rasterelektronenmikroskopen (REM) benötigen biologische und andere nichtleitende Proben eine elektrisch leitende Beschichtung - normalerweise wird Gold verwendet - um Aufladungen zu vermeiden und eine gute Abbildungsqualität zu erzielen. Alternativ gibt es spezielle Techniken wie die Abbildung mit sehr niedriger Strahl-Beschleunigungsspannung oder der Einsatz von Niedrig-Vakuum- (variable pressure) REMs, um nichtleitende Proben abzubilden. Hier wird die Nutzung der inneren Leitfähigkeit an einigen Beispielen botanischer Proben demonstriert, die mit vier verschiedenen REM-Techniken in konventionellen REMs abgebildet werden.

Frische, ungetrocknete Proben
Die Verwendung von Frischmaterial ist die einfachste und schnellste Präparationsmethode [2]. Viele Pflanzenteile, die mit einer dichten wasserundurchlässigen Kutikula bedeckt sind, trocknen auch im Hochvakuum so langsam aus, dass sie für einige Minuten, z.T. bis über eine Stunde, im REM untersucht werden können, bevor sie kollabieren und nicht-leitend werden. Solange sorgt das enthaltene Wasser für ausreichende Leitfähigkeit, dass die Proben ohne Metall-Bedampfung abgebildet werden können (Abb. 1). Die Farbbilder wurden durch Kombination von Sekundärelektronen- (SE-)Bild (Topographie) und Rückstreuelektronen- (RE-)Bild (Materialkontrast) erzeugt.

Glycerin-Infiltration
Schnelles Austrocknen von Frischproben (Abb. 2 a, b) kann verhindert werden, indem das Gewebswasser durch Glycerin ausgetauscht wird, das einen sehr niedrigen Dampfdruck hat, sodass die Proben stundenlang im REM stabil bleiben [3].

Die Infiltration von der Proben-Unterseite eignet sich besonders für Blätter mit hydrophober Oberfläche (Lotuseffekt), deren Oberseite bei der Präparation trocken und unberührt bleibt (Abb. 2 c). Auch die Glycerin-infiltrierten Proben haben ausreichende Leitfähigkeit. Dennoch kann eine zusätzliche Goldbedampfung vorteilhaft sein, da sie den Kontrast feiner Strukturen verbessert.

Cryo-REM
Einfrieren ist die sicherste Methode, um Artefakte durch Austrocknung zu vermeiden. Bei sehr tiefen Temperaturen reicht die Leitfähigkeit nicht aus, um Aufladungen zu verhindern, doch oberhalb von -100 °C verschwinden sie und die Bildqualität verbessert sich drastisch, sodass die Abbildung auch ohne Metallbedampfung möglich ist (Abb. 3 a, b) [4]. Auch langsames Einfrieren ist geeignet, wenn nur die Oberflächen der Proben untersucht werden sollen; die Bildung größerer Eiskristalle im Inneren macht sich hier nicht bemerkbar (Abb. 3 c). Ohne die Notwendigkeit von Metallbedampfung und Schockgefrieren kann einfache Cryo-Rasterelektronenmikroskopie schon mit selbstentwickeltem Equipment durchgeführt werden.

Chemische Behandlung von trockenen Proben
Die Einwirkung von reaktiven Dämpfen wie Chlorwasserstoff (HCl) kann Protonen-Leitfähigkeit in diversen biologischen Materialien erzeugen [5]. Für diverse Samen, Pollen oder Papier genügt eine Behandlung von 5 bis 20 Minuten, um Aufladungen im REM zu vermeiden (Abb. 4). Proben mit geringer Permeabilität erfordern längere Reaktionszeiten. Schutzmaßnahmen sollten beachtet werden, um Kontamination des REM mit HCl zu vermeiden, und beim Umgang mit konzentrierten Säuren.

Zusammenfassung
Die vier vorgestellten Methoden, die alle die innere Leitfähigkeit nutzen, vereinfachen die Probenpräparation. Verzicht auf die Metallbedampfung bietet Vorteile bei der Materialkontrast-Abbildung. Bei all diesen Methoden bleibt die Probenoberfläche unberührt; Immersion in Flüssigkeiten ist nicht nötig. Damit wird die Palette an REM-Präparationstechniken um einige einfache Methoden erweitert, die sich als praktisch erwiesen haben z. B. bei Arbeiten über superhydrophobe Pflanzenoberflächen, Biomineralisation, Kontamination und Pflanzenpathogene.

Literatur
[1] Echlin P.: Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. Springer, New York; 2009
[2] Ensikat H.J. et al.: Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Méndez-Vilas A. und Alvarez J. D. (Hrsg.); Vol. 1 (13); Formatex Research Center, Bajados, Spain; pp 248-255, 2010
[3] Ensikat H.J. und Barthlott W.: Journal of Microscopy 172, 195-203 (1993)
[4] Ensikat H.J. und Weigend M.: Microscopy and Analysis 27, 7-10 (2013)
[5] Ensikat H.J. und Weigend M.: Journal of Microscopy, in print (2014)

 


 

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