RNA Engineering

Rationales Design verschiedener Varianten des Hairpinribozyms

  • Abb. 1: Austausch von RNA-Segmenten durch Twinribozyme. Modelle für die Reparatur einer Deletionsmutation (oben), Insertionsmutation (Mitte) und Basenaustauschmutation (unten).Abb. 1: Austausch von RNA-Segmenten durch Twinribozyme. Modelle für die Reparatur einer Deletionsmutation (oben), Insertionsmutation (Mitte) und Basenaustauschmutation (unten).
  • Abb. 1: Austausch von RNA-Segmenten durch Twinribozyme. Modelle für die Reparatur einer Deletionsmutation (oben), Insertionsmutation (Mitte) und Basenaustauschmutation (unten).
  • Abb. 2: Prinzip der allosterischen Regulation der Aktivität des Hairpinribozyms. a) Änderung der FMN-Molekülgeometrie in Abhängigkeit vom Oxidationszustand. b) Abhängigkeit der Ribozymaktivität vom FMN-Oxidationszustand. Nur oxidiertes FMN kann in der Apatamerregion binden und über das Kommunikationsmodul (rot) die Ribozymstruktur stabilisieren. Die Aktivität ist ON. Reduktion von FMN führt zum Bindungsverlust, was eine Destabilisierung der Ribozymstruktur zur Folge hat. Die Aktivität ist OFF.

RNA Technologie: Die Forschung der vergangenen zwanzig Jahre hat eindeutig gezeigt, dass Proteine nicht das Monopol biologischer Katalyse besitzen. Anfang der achtziger Jahre sind die ersten katalytischen RNAs entdeckt worden [1, 2] und der Name „Ribozym" (von Ribonukleinsäure und Enzym) wurde eingeführt. Ganz analog zu Enzymen, die aus Proteinen bestehen, sind Ribozyme tertiär gefaltete Moleküle, die aktive Zentren zur Katalyse chemischer Reaktionen aufweisen. Das Spektrum der heute bekannten Ribozym-katalysierten Reaktionen reicht von Umesterungen über die Peptidsynthese bis hin zu klassischen Reaktionen der organischen Chemie wie die C-C Bindungsknüpfung nach Diels-Alder [3].

Das Hairpinribozym
Das Hairpinribozym ist eine kleine katalytische RNA, die als Strukturmotiv in der Satelliten-RNA des Tobacco-Ringspot-Virus vorkommt, und an deren Selbstprozessierung im Zuge der Replikation beteiligt ist [4 - 6]. Das Hairpinribozym katalysiert sowohl die Spaltung als auch die Knüpfung einer RNA-Phosphorsäurediesterbindung [7]. Dabei lässt sich die Spalt- und Ligationsaktivität über die Struktur des Ribozym-Substrat-Komplexes programmieren. Die Liagtion ist enthalpisch bevorzugt und schneller als die Spaltung. Daraus folgt, dass RNA-Substrate, die stabil am Hairpinribozym gebunden sind, stärker ligiert werden als Substrate, die locker gebunden sind und somit leicht dissoziieren können. Das Entgegengesetzte gilt für die Spaltung. Destabilisierung des Ribozym-Substrat   / Produkt-Komplexes führt also zu bevorzugter Spaltung, Stabilisierung entsprechend zu bevorzugter Ligation. Diese „Schaltbarkeit" lässt sich zur Steuerung funktioneller Prozesse nutzen.

Hairpin-Twinribozyme für die Gentherapie
Neben anderen RNAs besitzen Ribozyme ein großes Potenzial für gentherapeutische Anwendungen; antisense-RNA, interferierende RNA (RNAi) und trans-spaltende Ribozyme lassen sich zur Verhinderung unerwünschter Genexpression einsetzen. Diese Art von Gentherapie ist sinnvoll, wenn es darum geht, die Synthese eines Proteins mit pathogener Wirkung für die Zelle zu verhindern.

Eine Krankheit, deren Ursache jedoch eine Genmutation ist, erfordert weniger eine Strategie zur Inhibierung als vielmehr eine Strategie zur Korrektur der genetischen Information. Ribozyme könnten sich als wirksame Werkzeuge für die Korrektur genetischer Informationen auf RNA-Ebene erweisen. Die Reparatur des Transkripts eines defekten Gens ist gegenüber der klassischen Methode des direkten Gentransfers möglicherweise von Vorteil, da mRNAs, die genetische Fehler enthalten, korrigiert werden, während die natürliche Genexpression erhalten bleibt. Eine generelle Methode zur Manipulation eines willkürlich gewählten RNA-Abschnitts erfordert ein Agens, das in strikt kontrollierter Art und Weise zwei RNA-Spaltungen und zwei Ligationen katalysiert. Wir haben ausgehend vom natürlich vorkommenden Hairpinribozym durch Kombination zweier katalytischer Einheiten in einem Molekül Twinribozyme entwickelt, die diese Anforderung erfüllen [8-12] (Abbildung 1). Um zunächst die Reparatur einer kleinen Deletion auf RNA-Ebene zu simulieren, wurde der Prototyp eines Twinribozyms so konstruiert, dass es die Insertion von vier Nukleotiden an einer spezifischen Position der Substrat-RNA unterstützt [8]. Im Ribozym/Substrat-Komplex ist eine Folge von vier Nukleotiden (GAUU) im mittleren Bereich des Ribozymstrangs ausgestülpt (Abb. 1, oben). Spaltung an beiden definierten Orten führt zur Entstehung eines Fragments, das durch den destabilisierenden Einfluss der einzelsträngigen GAUU-Schleife leicht vom Ribozymstrang dissoziieren kann. Die beiden RNA-Fragmente, welche die Spaltorte flankieren, bilden dagegen stabile Duplexe mit dem Ribozym, und bleiben vorzugsweise gebunden. Das zugegebene Reparaturoligonukleotid enthält die vier zusätzlichen Nukleotide, die komplementär zur Schleife im Ribozymstrang sind. Als Folge wird durch Bindung dieses Reparaturoligonukleotids der ursprünglich unterbrochene Doppelstrang um vier Nukleotide zu einem kontinuierlichen Duplex verlängert. Im Ergebnis bewirkt das Twinribozym die spezifische Insertion von vier Nukleotiden in die Mutter-RNA; bis zu 52 % des Ausgangssubstrats ließen sich in das Insertionsprodukt überführen [9]. In ähnlicher Art und Weise lassen sich auch längere gegen kürzere oder sogar gleichlange RNA-Segmente austauschen [9, 11]. Die Destabilisierung des Twinribozym-Substratkomplexes erfolgt dabei durch einen Loop im Substratstrang oder durch Mismatches. Die Untersuchungen zur RNA-Reparatur wurden zunächst mit willkürlich gewählten Sequenzen durchgeführt. Das Wildtyp-Hairpinribozym lässt sich jedoch in seiner Substratsequenz unter Erhalt der katalytischen Aktivität variieren und kann so verschiedene RNAs erkennen und prozessieren. Kürzlich haben wir ein Twinribozym entwickelt, das in vitro eine Drei-Basen-Deletion im Transkript eines mutierten Onkogens mit 35 % Ausbeute repariert [12].

Allosterisch regulierbare Hairpinribozyme
Die Aktivität von Ribozymen ist allosterisch regulierbar. Hierzu wird in der Regel ein Ribozym mit einer spezifischen Aptamersequenz kombiniert. Aptamere sind RNAs die mit hoher Affinität und Spezifität Liganden binden. Die Faltungsstruktur von allosterischen Ribozymen (auch Aptazyme genannt) wird durch die Bindung des Liganden stark beeinflusst. In Anwesenheit des Liganden werden bestimmte konformelle Faltungsmuster innerhalb der Ribozymdomäne erzwungen, die zur Verringerung oder Erhöhung der katalytischen Aktivität führen. Auf diese Weise wurde eine Reihe von molekularen Schaltern entwickelt, deren Aktivität gezielt kontrolliert werden kann.

Wir haben Hairpinribozyme entwickelt, deren Aktivität abhängig von Flavinmononukleotid (FMN) ist [13, 14] (Abb. 2). Durch Kombination des Hairpinribozyms mit der FMN-abhängigen Aptamersequenz über diverse Brückenmotive wurden drei verschiedene allosterische Varianten entworfen. Alle Systeme zeigten in Abwesenheit von FMN eine verringerte, und nach Zugabe des Liganden eine erhöhte bzw. vollständig regenerierte Spaltaktivität. Eines dieser Systeme wurde weiterentwickelt und die reversible Schaltung über die Kontrolle der Molekülgeometrie des Effektors demonstriert [13]. Durch Reduktion von FMN werden strukturelle Veränderungen innerhalb des Moleküls hervorgerufen; FMN wechselt von einer planaren in eine gewinkelte dachartige Struktur, was mit einer Aufhebung der Bindung in der Aptamerdomäne einhergeht. Die spontane Re-oxidation von FMN durch den anwesenden Sauerstoff führt zur Regenerierung der planaren Struktur, zur Bindung im Aptamer und zu wiederhergestellter katalytischen Aktivität. Diese Reversibilität des Schaltvorganges konnte durch chemische [13] und elektrochemische [14] Reduktion / Oxidation demonstriert werden.

Selbstspleißende Hairpinribozyme
Am Beginn eines weiteren Projekts stand die Frage, ob durch gezielte Sequenzprogrammierung ein RNA-Molekül erzeugt werden kann, das eine Kaskade von Spalt- und Ligationsreaktionen durchläuft und dabei seine Topologie ändert. Wir haben zu diesem Zweck ein RNA-Molekül entworfen, das intern die Hairpinribozymstruktur enthält und in zwei alternative Konformationen falten kann [15, 16]. Nach Herstellung durch in vitro Transkription entsteht so eine Hairpinribozymvariante in zwei zunächst spaltaktiven Konformationen, die die sequenzielle Abspaltung des 5‘- und 3‘-Terminus unterstützen. Im Resultat bleibt eine verkürzte RNA zurück, die die zur Ligation erforderlichen Funktionalitäten, eine 5‘-OH-Gruppe und ein 2‘, 3‘-Zyklophosphat, trägt. Das ermöglicht die intramolekulare Ligation zu einer zyklischen RNA als Endprodukt der Spalt- und Ligationskaskade. Darüber hinaus laufen auch intermolekulare Reaktionen ab, die zu einer Konkatemerisierung führen. Die Analyse der Reaktion und ihrer Produkte gelang durch verschiedene biochemische Verfahren, sowie durch Atomic Force Microscopy (AFM). Weiterhin wurden durch computergestützte Methoden neue selbst-prozessierende Hairpinribozymvarianten mit Präferenz zur Zyklierung bzw. Konkatemerisierung entworfen und charakterisiert. Die demonstrierte Selbstprozessierung einer RNA zu einer zyklischen Spezies oder zu einem Konkatemer hat beispielsweise Relevanz für RNA-Welt-Szenarien. Eine weithin akzeptierte Theorie zur Entstehung des Lebens geht davon aus, dass eine RNA-Welt existiert hat, in der RNA-Moleküle sowohl als Träger der Erbinformation als auch als Helfermoleküle (Katalysatoren) zu deren Weitergabe und Prozessierung dienten [17]. RNAs mit der Fähigkeit zur Zyklisierung könnten durch die erreichte höhere Stabilität einen Selektionsvorteil besessen haben. Das Potenziel zur Konkatemerisierung könnte hinsichtlich größerer RNAs (Genome) und damit potenziell größerer Komplexität vorteilhaft gewesen sein.

Hairpinribozyme als Rekombinasen
Ebenfalls mit Relevanz für RNA-Welt-Szenarios haben wir Hairpinribozymvarianten zur Unterstützung von RNA-Rekombinationen entwickelt. Die oben bereits erwähnten Twinribozyme lassen sich zu diesem Zweck nutzen, da Segmente verschiedener RNAs ausgetauscht werden. Diese Aktivität lässt sich zum Beispiel auch für die gezielte Funktionalisierung  /  Markierung von großen nichtsynthetischen RNAs nutzen, indem synthetische spezifisch funktionalisierte Oligonukleotide Twinribozym-unterstützt in eine spezifische RNA eingefügt werden [9].

In einer weiteren Arbeit konnten wir zeigen, dass sich funktionelle Hairpinribozyme durch Spaltung von Vorläufersubstraten und Selbstligation der entstehenden Fragmente herstellen lassen [18]. Darüber hinaus ist es uns gelungen die RNA-katalysierte Rekombination von zwei nichtfunktionellen RNAs zu einer funktionellen RNA, in diesem Fall ein selbst-spaltendes Hammerheadribozym, zu erreichen. Diese Arbeiten werden aktuell weitergeführt zur Demonstration eines breiten Rekombinationspotenzials von Hairpinribozymstrukturen mit RNA-Welt-Relevanz.

Zusammenfassung
Insgesamt zeigen unsere Arbeiten zum rationalen Design von Hairpinribozymvarianten die enge Verbindung von RNA-Struktur und -Funktion. Strukturelle Veränderungen am originalen Hairpinribozym haben RNA-Katalysatoren mit neuen funktionellen Eigenschaften hervorgebracht, wobei jedoch die Grundaktivität, Spaltung und Ligation von Phosphorsäurediesetrbindungen, beibehalten wurde. Unsere eigenen sowie die Arbeiten anderer Gruppen zum Ribozymdesign insgesamt zeigen, dass die Prinzipien der natürlichen RNA-Katalyse inzwischen zu einem Grad verstanden sind, der es erlaubt, RNA-Katalysatoren für einen bestimmten Zweck zu entwickeln und anzuwenden.

Referenzen
[1] Cech T. R. et al.: Cell, 27, 487-496 (1981)
[2] Guerrier-Takada C. et al.: Cell, 35, 849-857 (1983)
[3] Cech T. R.: Biochem. Soc. Trans., 30, 1162-1166 (2002)
[4] Buzayan J. M. et al.: Nucleic Acid Research, 14, 9729-9743 (1986)
[5] Feldstein P. A. et al.: Gene, 82, 53-61 (1989)
[6] Hampel A. und Tritz R.: Biochemistry, 28, 4929-4933 (1989)
[7] Hegg L. A. und Fedor M. J. Biochemistry, 34, 15813-15828 (1995)
[8] Welz R. et al.: Angew. Chem. Int. Ed. 42, 2424-2427 (2003)
[9] Vauléon S. et al.: ChemBioChem 6, 2158-2162 (2005)
[10] Ivanov S. A. et al.: FEBS J. 272, 4464-4474 (2005)

Weitere Literatur ist bei der Autorin erhältlich.

 

Autor(en)

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Felix-Hausdorff-Str. 4
17489 Greifswald

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