Single-Use Bags in Zellkulturprozessen

Identifizierung kritischer Single-Use Filme

  • Abb. 1: Beispiel für den Einfluss von Leachables/ Extractables auf das Wachstum einer CHO Zelllinie. Verlauf der viablen Zelldichte über den Zeitraum eines Batch Versuchs im Schüttelkolbenmaßstab. Das Medium für diesen Zellkulturversuch wurde im Vorfeld in Glasflaschen bei ( ■ ) 4 °C und ( ■ ) 20 °C bzw. in einem Bag bei ( ▲ ) 20 °C inkubiert.Abb. 1: Beispiel für den Einfluss von Leachables/ Extractables auf das Wachstum einer CHO Zelllinie. Verlauf der viablen Zelldichte über den Zeitraum eines Batch Versuchs im Schüttelkolbenmaßstab. Das Medium für diesen Zellkulturversuch wurde im Vorfeld in Glasflaschen bei ( ■ ) 4 °C und ( ■ ) 20 °C bzw. in einem Bag bei ( ▲ ) 20 °C inkubiert.
  • Abb. 1: Beispiel für den Einfluss von Leachables/ Extractables auf das Wachstum einer CHO Zelllinie. Verlauf der viablen Zelldichte über den Zeitraum eines Batch Versuchs im Schüttelkolbenmaßstab. Das Medium für diesen Zellkulturversuch wurde im Vorfeld in Glasflaschen bei ( ■ ) 4 °C und ( ■ ) 20 °C bzw. in einem Bag bei ( ▲ ) 20 °C inkubiert.
  • Abb. 2: Schematischer Ablauf des Zellkulturtests

Die Single-Use Technologie hat in den vergangenen Jahren in der biopharmazeutischen Industrie immer mehr an Bedeutung gewonnen. Insbesondere im Bereich des Upstream Processing werden Single-Use Systeme (SUS) als Bioreaktoren, Medien- und Pufferbags eingesetzt. Die Nutzung solcher Systeme kann sich jedoch in manchen Fällen negativ auf die zu kultivierenden Zellen auswirken. Dies kann unter anderem auf Leachables und / oder Extractables zurückzuführen sein, die sich aus den SUS herauslösen.

Single-Use Bags in der Industrie
Zunehmend werden in Zellkulturprozessen der biopharmazeutischen Industrie Single-Use Kultivierungsbags in Form von wellendurchmischten und gerührten Bioreaktoren als auch Single-Use Bags zur Medien und Pufferlagerung eingesetzt. Allerdings wird in der Literatur immer wieder berichtet, dass diese Systeme Einfluss auf die Zellkulturprozesse nehmen können. Genannt werden hierbei meist Leachables / Extractables. Dies sind chemische Substanzen, die beispielsweise bei der Gamma-Sterilisation der Materialien entstehen können und sich im Zellkulturprozess negativ auswirken [1]. Die eingesetzten Bags sind meist aus Multilayer-Filmen aufgebaut, wobei der mit der Zellkultur in Berührung kommende Kontaktlayer aus Polyethylen oder Ethylenvinylacetat besteht. Hammond et al. [1] konnten zeigen, dass spezifische Komponenten, die bei dem Herstellprozess der Bagfilme eingesetzt werden bei einer anschließenden gamma Sterilisation der Bags zu cytotoxischen Substanzen führen. Diese Komponenten gehen beim Kontakt mit dem Zellkulturmedium in dieses über und können den Zellkulturprozess hinsichtlich Zellwachstum und Produktivität stark beeinflussen (Abb. 1).

Bewertung von Single-Use Filmen
Bislang werden vornehmlich Extractable-Studien für die Bags bzw. deren Filme durchgeführt, um diese zu bewerten. Zunehmend wird aber deutlich, dass auch zellkulturbasierte Studien für eine umfassende Bewertung solcher Materialien notwendig sind [2, 3]. Eine Schwierigkeit liegt darin, dass die Auswirkung der Leachables / Extractables abhängig vom eingesetzten Medium und der Zelllinie variieren kann.

Aufgrund dessen führen eine Vielzahl von Anwendern dieser Single-Use Materialien vor ihrer Implementierung in den Prozess eigenständige Qualitätskontrollen in Form von Zellkultur-Studien durch, deren Ergebnisse sich aber auf Grund der unterschiedlichen Durchführungsprotokolle, eingesetzten Medien sowie Zelllinien nicht vergleichen lassen.

Standardisierter Zellkulturtest zur Bewertung von Bagfilmen
Der Dechema Arbeitskreis „Single- Use -Technolgie in der Biopharmazeutischen Produktion" hat in zwei aufeinanderfolgenden Ringversuchen einen standardisierten Zellkulturtest für CHO Zelllinien in chemisch definierten Medien etabliert, der zur Bewertung von Bagfilmen herangezogen werden kann [4, 5]. Ziel hierbei war es Herstellern sowie Anwendern von SUS einen Zellkulturtest als zusätzliche Qualitätskontrolle zur Verfügung zu stellen. Dieser basiert auf einem frei kommerziell erhältlichen Medium und einer ebenso frei erhältlichen Zelllinie.

In einem ersten Ringversuch wurde unter den Anwendern ein Testprozedere definiert, nach welchem Medien mit den zu testenden Filmen vor dem eigentlichen Zellkulturtest inkubiert werden, um potenzielle cytotoxische Substanzen aus den Bags herauszulösen [4]. In einem nachfolgenden Ringversuch wurden zusätzlich zwei kommerziell erhältliche Medien und Zelllinien in die Testung miteinbezogen, um zu prüfen, ob diese die unterschiedlichen Ergebnisse, die mit verschiedensten Medien und Zelllinien erhalten wurden, wiederspiegeln.

In den zwei Ringversuchen wurden im Gesamten 20 Bag-Materialien durch 4 Anwender aus der Industrie und einen akademischen Anwender getestet, wobei die Ergebnisse zwischen den unterschiedlichen Zelllinien leicht variierten. Hierbei zeigte sich, dass der neu etablierte Zellkulturtest mit einem frei kommerziell erhältlichen Medium in Kombination mit einer ebenso frei zur Verfügung stehenden Zelllinie zu einer vergleichbaren Bewertung der untersuchten Filme führte, wie sie für verschiedene Zelllinien aus der Industrie erhalten wurde.

Durchführung des Zellkulturtests und Ergebnisbewertung
Der vollständige Zellkulturtest zur Bewertung von SUS ist aus zwei Versuchsreihen aufgebaut. In einem ersten Ansatz wird Wasser in den zu testenden Bags inkubiert. Anschließend wird mit Hilfe des vorinkubierten Wassers das Medium für den Zellkulturtest hergestellt. Dieser erste Ansatz gibt später Auskunft darüber, ob ein möglicher Einfluss auf das Wachstum der Zellen durch eine Adsorption von Medienkomponenten an den Film zustande kommt. In einem zweiten Ansatz wird das Zellkulturmedium direkt in dem Bag inkubiert (Abb. 2).

Anschließend wird mit beiden Medien ein Schüttelkolbenversuch im Batch Format durchgeführt. Eine detaillierte Beschreibung zur Durchführung der Zellkulturversuche sowie deren Auswertung geht aus der Dechema Empfehlung [5] des Arbeitskreises „Single-Use-Technologie in der Biopharmazeutischen Produktion" hervor. Die Auswertung der beiden zellkulturbasierten Versuche erfolgt anhand von Bewertungskriterien, die sich auf die erreichten Zelldichten, Vitalitäten sowie Metabolitverläufe beziehen. Die Summe aller Bewertungskriterien gibt Aufschluss darüber, ob sich ein Bag (Film) für die Anwendung in der Zellkultur eignet.

Zusammenfassung
Im Rahmen von Ringversuchen wurde ein standardisierter Zellkulturtest etabliert, der für die Bewertung von SUS für die Zellkultivierung herangezogen werden kann. Die Komponenten des Tests sind frei kommerziell erhältlich, so dass Hersteller sowie Anwender von SUS die eingesetzten Systeme auf ihre Eignung hin testen können.

Literatur
[1] M. Hammond et al.: PDA J Pharm. Sci. and Tech. 67, 123-134 (2013)
[2] J. Wood et al.: DOI: 10.1002/btpr.1802 (2013)
[3] B. Horvath et al.: BioPharm. Int. 23(6), 34-41 (2013)
[4] N. Steiger und R. Eibl: Chemie Ingenieur Technik 85 (1-2), 26-28 (2013)
[5] R. Eibl R und N. Steiger: http://www.dechema.de/dechema_media/SingleUse_Empfehlung_Leachables_2014-p-4692.pdf (2014)

Autoren
Dr. Christina Fritz1, Prof. Dr. Regine Eibl2,
Dr. Dethardt Müller3, Dr. Detlef Eisenkrätzer1,
Dr. Joachim Bär4, Prof. Dr. Dieter Eibl2

1Roche Diagnostics
2Züricher Hochschule für Angewandte
Wissenschaften (ZHAW)
3Rentschler Biotechnologie
4Boehringer Ingelheim Biopharmaceuticals

 

Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/category/tags/bioprozesstechnik
Dechema Empfehlung für Leachable Studie [5]: http://www.dechema.de/dechema_media/SingleUse_Empfehlung_Leachables_2014-p-4692.pdf

 

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