Strukturierungsmethoden: Mit Proteinen Bilder malen

  • Abb. 1: Übersicht der wichtigsten Strukturierungsmethoden. Beispiele für serielle Verfahren: A) Spotting mittels Kapillare oder B) dip-pen nanolithography mit einem aus der Rasterkraftmikroskopie bekannten Cantilever. Parallele Verfahren zur Herstellung von strukturierten Oberflächen sind z. B. C) Mikrokontaktdruck mittels eines Stempels oder lithographische Methoden wie D) DMD-basiertes Strukturieren.Abb. 1: Übersicht der wichtigsten Strukturierungsmethoden. Beispiele für serielle Verfahren: A) Spotting mittels Kapillare oder B) dip-pen nanolithography mit einem aus der Rasterkraftmikroskopie bekannten Cantilever. Parallele Verfahren zur Herstellung von strukturierten Oberflächen sind z. B. C) Mikrokontaktdruck mittels eines Stempels oder lithographische Methoden wie D) DMD-basiertes Strukturieren.
  • Abb. 1: Übersicht der wichtigsten Strukturierungsmethoden. Beispiele für serielle Verfahren: A) Spotting mittels Kapillare oder B) dip-pen nanolithography mit einem aus der Rasterkraftmikroskopie bekannten Cantilever. Parallele Verfahren zur Herstellung von strukturierten Oberflächen sind z. B. C) Mikrokontaktdruck mittels eines Stempels oder lithographische Methoden wie D) DMD-basiertes Strukturieren.
  • Abb. 2: Testmuster und Visualisierung der Reproduktion durch maskenlose DMD-basierte Lithographie. A) Originalbild (das invertierte Bild wurde für die Lithographie verwendet). B) Fluoreszenzbild des mit Streptavidin-Cy3 gefärbten Musters, Expositionsdauer: 1 min. Skala = 500 μm. Das Fluoreszenzsignal ist in Graustufen (16 bit) entsprechend der nebenstehenden Skala dargestellt. C) Projektion der Fluoreszintensität und deren farbliche Codierung errechnet aus (B). Die nebenstehende Farbskala zeigt die Fluoreszenzintensität der Pixel. ([10] mit freundlicher Genehmigung von Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.)
  • Abb. 3a): Illustration unterschiedlicher Anwendungsgebiete DMD-basierter Lithographie.
  • Abb. 3b): Streptavidin-Cy3 Muster einer feingliedrigen Reproduktion mit großem Dynamikbereich, Skala: 200 μm. B) Biokompatibles Fibronectinmuster (rote Linien bzw. Quadrate) auf BSA mit migrierenden Neuralleistenzellen aus Xenopus laevis. Skala: 50 μm.

Um die Reaktion von Zellen auf ihre Umgebung zu untersuchen, sind oberflächengebundene Proteinmuster definierter Dichte und Form ein wichtiges Werkzeug. In lebenden Systemen beeinflussen sowohl Gradienten löslicher Signalmoleküle, als auch die Anordnung von Proteinen und Oligosacchariden auf der Zelloberfläche Prozesse wie Adhäsion, Migration und Differenzierung von Zellen.

Laterale Proteinmuster
Können diese komplizierten Biomolekülmuster verlässlich nachgebildet werden, erlaubt dies Experimente, die zu einem tieferen Verständnis dieser elementaren Prozesse führen. Solche Erkenntnisse wiederum ermöglichen das Design von Biomaterialien, die z.B. die Zelldifferenzierung gezielt beeinflussen, und können somit zur Entwicklung verträglicher Implantate, neuraler Schnittstellen oder künstlicher Sensoren beitragen.

Um in biologischen Studien valide Daten generieren zu können, müssen Versuchsreihen unter reproduzierbaren Bedingungen durchgeführt werden. Hierzu können wiederkehrende Muster beispielsweise auf dem Boden der Kavitäten von Mikrotiterplatten aufgebracht werden. Häufig werden auch parallele Versuche auf größeren Mustern in der Größe von einigen mm² oder cm² durchgeführt. Daraus ergibt sich ein Bedarf für schnelle, einfache und reproduzierbare Verfahren zur Herstellung definierter Muster von Biomolekülen. Proteine und Peptide sind dabei wegen ihrer guten Zugänglichkeit und Modifizierbarkeit von besonderem Interesse. In der Literatur wurden unterschiedliche Methoden für die Herstellung lateraler Proteinmuster vorgestellt. Manche Techniken sind auf binäre Muster limitiert, andere bilden ein kontinuierliches Konzentrationsgefälle ab und weitere führen zu flexiblen Mustern unterschiedlicher Proteindichte.

Spotting mit Kapillaren
Eine einfache Methode zur Herstellung binärer Muster ist das punktuelle Aufbringen von Proteinlösungen auf Oberflächen (spotting, Abb. 1, A), wie es für die Herstellung von Mikroarrays entwickelt wurde. Anordnungen von Proteinpunkten in der Größenordnung von 20 – 200 μm wurden häufig eingesetzt, um Zellen in definierten Positionen in Form von Zellmikroarrays zu kultivieren [1]. Um die Reaktion von Säugerzellen mit einer Größe von 10 – 80 μm auf die Anordnung von Proteinen zu untersuchen, werden Muster mit einer Auflösung im unteren Mikrometerbereich und kleiner benötigt.

Solche Punktmuster sind mit feinen Kapillaren zugänglich. Unter Anlegen einer Spannung wurden mit einem Kapillardurchmesser von 100 nm Punktgrößen von 5 μm erzielt. Dabei können definierte Muster aus einzelnen Punkten aufgebaut werden [2].

Dip-Pen Nanolithographie (DPN)
Kleinere Strukturen mit einer Auflösung von wenigen 10 Nanometern können mit der Technologie der Rasterkraftmikroskopie erzeugt werden. Bei der dip-pen nanolithography (DPN) werden mithilfe eines modifizierten Cantilevers funktionalisierte Thiole oder Silane auf Goldoberflächen aufgetragen, die anschließend mit niedermolekularen Liganden oder Proteinen konjugiert werden (Abb. 1, B). Auch der direkte Transfer von Proteinen ist möglich [3].

Mikrokontaktdruck (μCP)
Eine weit verbreitete Technik ist der sogenannte Mikrokontaktdruck oder micro contact printing (μCP), bei dem durch strukturierte Elastomerstempel funktionelle Moleküle auf Oberflächen transferiert werden (Abb. 1, C). Typischerweise werden hierbei weiche hydrophobe Elastomere wie Polydimethylsiloxan eingesetzt, die homogen mit funktionalisierten Silanen, Thiolen oder Biomolekülen benetzt werden, um komplexe Muster mit einer Auflösung im Submikrometerbereich innerhalb von Sekunden auf ebene Oberflächen zu übertragen [4]. Die Stempel können wiederholt verwendet und damit eine große Anzahl uniformer Muster hergestellt werden. Gradienten müssen hierbei durch binäre Muster aus Linien oder Punkten in zunehmender Dichte oder Dicke angenähert werden [4]. Wenn Proteinlösungen von einer Seite aus in flache Agarosestempeln eindiffundieren, lassen sich die entstehenden kontinuierlichen Gradienten direkt auf eine Oberfläche übertragen [5].

Mikrofluidische Netzwerke (μFN)
Eine Alternative zum μCP ist die Verwendung von mikrofluidischen Netzwerken (μFN). Dabei werden Kanalstrukturen in einer Elastomermatrix auf das Substrat gedrückt und mit Proteinlösung gefüllt, aus der Proteine an die Oberfläche adsorbieren. Durch parallele Kanäle, die mit Proteinlösungen verschiedener Konzentration gefüllt werden, lassen sich Gradientenmuster aufbauen [4].

Photolithographie
Auch durch photolithographische Prozesse können definierte Proteinmuster hergestellt werden. Dabei gilt es, die etablierten Technologien an die Erfordernisse der Biomoleküle anzupassen und z. B. Proteinschäden durch hochenergetische UVStrahlung zu verhindern oder toxische Reagenzien zu vermeiden, die in späteren Arbeitsschritten ausbluten und zellbasierte Studien verfälschen können. Häufig angewendet wird die photoinitiierte radikalische Polymerisation ungesättigter Verbindungen wie Acrylate. Durch photopolymerisierbare Resiste können Muster entweder in Anlehnung an klassische lift-off oder photolithographisch basierte Ätzverfahren erzeugt werden, die im Laufe des Verfahrens mit Proteinen modifiziert werden [6].

Die durch Belichtungsmuster strukturierte Bindung von Proteinen kann auch über photoaktivierbare Gruppen erfolgen, die homogen auf die Oberfläche aufgebracht und durch Belichtung aktiviert werden. Dabei können entweder durch Abspaltung photoaktivierbarer Schutzgruppen funktionelle Gruppen freigegen, oder reaktive Gruppen wie Radikale oder Carbene photochemisch erzeugt werden [7].

Bei der Proteinadsorption durch Photobleichen (PAP) wird eine proteinbeschichtete Oberfläche mit einem fluoreszenzmarkierten Liganden inkubiert und in der Anregungswellenlänge des Fluorophors überbelichtet. Dabei entsteht aus dem angeregten Fluorophor eine reaktive Spezies, die kovalent an das Protein auf der Oberfläche bindet. Im Gegensatz zu anderen photochemischen Verfahren ist diese Methode in wässrigen Puffern durchführbar und arbeitet mit sichtbarem Licht statt mit UV-Licht [8].

Wenn Licht für die Oberflächenstrukturierung verwendet wird, können durch Variation der Belichtungszeiten oder der Intensität unterschiedliche Proteindichten immobilisiert werden. Durch Abrastern einer Oberfläche mit einem Lichtstrahl steuerbarer Intensität können digitalisierte Graustufenbilder als Proteinmuster auf Oberflächen übertragen werden. Unter Verwendung von spatial light modulators (SLM), die die pixelbasiert steuerbare dynamische Erstellung einer Graumaske erlauben, können beliebige Motive auf die Oberfläche projiziert und mit dem PAPVerfahren in Proteinmuster „übersetzt“ werden. Dies wurde von Bélisle et al. unter Verwendung translucider Flüssigkristalldisplays [9] und kürzlich von uns unter Verwendung eines frei programmierbaren Mikrospiegelarrays (digital mirror device, DMD) vorgestellt. Die aus der Projektionstechnik bekannten Mikrospiegelarrays bestehen aus einer Matrix einzeln ansteuerbarer mikroskaliger Spiegel, die durch Oszillation mittels Pulsweitenmodulation unterschiedliche Grauwerte wiedergeben können (Abb. 1, D). Bei der Durchführung des PAP-Verfahrens mit DMD-Belichtung wurden schon nach wenigen Sekunden definierte Graustufenmuster von Biomolekülen erhalten (Abb. 2) [10].

Zusammenfassung
Alle hier vorgestellten Methoden können in direkte und replikative Techniken eingeteilt werden. Bei den direkten Verfahren (auch Schreibverfahren) wird ein Muster durch das Verfahren einer Kanüle (beim Spotting), einer feinen Spitze (Cantilever bei der DPN) oder eines Lichtstrahls (bei der Photolithographie) in xy-Richtung entsprechend einer digitalen Vorlage erzeugt. Die Bearbeitungszeit ist umso länger, je größer die geforderte Fläche und Auflösung ist. Durch Anpassung der digitalen Vorlage lässt sich das Muster einfach variieren. Replikative Techniken erzeugen Muster mithilfe eines Templats. Dazu gehören Mikrokontaktdruck und mikrofluidische Netzwerke, die eine Elastomerstruktur als Templat verwenden, sowie die maskenbasierten photolithographischen Verfahren. Die Dauer des Replikationsprozesses ist unabhängig von Größe oder Auflösung des Musters, und es können mehrere Muster parallel transferiert werden. Produktion oder Modifikation der Replikationsstrukturen sind jedoch zeitaufwändig und kostspielig. Photolithographische Verfahren, bei denen das Lichtmuster durch Lichtmodulatoren dynamisch verändert wird, vereinen die Vorteile der einfachen Musteranpassung mit der beliebigen Reproduzierbarkeit von Mustern in der Größe von wenigen mm² bis cm². Wegen ihrer Vielseitigkeit (vgl. Abb 3.) wird die Photoimmobilisierung von Biomolekülen durch dynamische Belichtungsverfahren in Zukunft eine wichtige Rolle bei der Untersuchung zellulärer Antworten auf Oberflächenstrukturen spielen.

Literatur
[1] Castel D. et al.: Drug Discov Today 11, 616-622 (2006)
[2] Bruckbauer A. et al.: J Am Chem Soc, 125, 9834- 9839 (2003)
[3] Lim J.-H. et al.: Angew Chem 115, 2411-2414 (2003)
[4] A. C. et al., Sci STKE 2007, 2007, pl6.
[5] von Philipsborn M. und Mayer et al.: Proteomics, 4, 2366-2376 (2004)
[6] Douvas A. et al.: Biosens Bioelectron 17, 269-278 (2002)
[7] Chen, aS. und Smith, L. M.: Langmuir, 25, 12275- 12282 (2009) bT Matsuda und Sugawara T.: J Biomed Mater Res 1995, 29, 749-756; cC. R. Toh, et al.: Langmuir, 25, 8894-8898 2009
[8] Holden M. A. und Cremer P. S.: J Am Chem Soc 125, 8074-8075 (2003)
[9] Bélisle J. M. et al.: Lab Chip 9, 3580-3585 (2009)
[10] Waldbaur A. et al.: Small, 8, 1570–1578 (2012)

Weitere Literatur ist bei den Autoren erhältlich.

 

Autor(en)

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Technische Universität Darmstadt - Clemens-Schöpf-Institut für Organische Chemie und Biochemie
Petersenstrasse 22
64287 Darmstadt

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