Synthetische Biologie: Ein neuer Zugang zum Verständnis biologischer Phänomene

  • Abb. 1: a) Skizze von Rafts in Zellmembranen. Rafts bestehen aus einer Verbindung von Lipiden und Proteinen mit Membraneigenschaften, die sie vom Rest der Membran unterscheiden. b) Raft-ähnliche Domänen einer Phasen-trennenden Lipid-Doppelschicht, die in unilamellaren Riesenvesikeln (GUV) bestehend aus DOPC, Sphingomyelin und Cholesterin (im molaren Verhältnis von 1:1:1) beobachtet wurden. GUVs können als ein Minimalkonzept einer biologischen Zellmembran betrachtet werden. Nachdruck mit Erlaubnis von Science, Copyright (2008) [10], und Biophs. J., Copyright (2004) [3].
  • Abb. 2: Differentialinterferenzkontrast (DIC) und Min-Oszillationen bei Escherichia coli. Maßbalken: 2 μm, Zeitskala: Sekunden. Nachdruck mit Erlaubnis von EMBO J., Copyright (2001) [8].
  • Abb. 3: Skizze von Min-Proteinoszillationen in E.coli (in vivo) und Übertragung auf eine künstliche Doppelschicht (in vitro).
  • Abb. 4: Min-Dynamik in vitro: Statt in Oszillationen wie in vivo breiten sich die Min-Bindungsmuster auf einer künstlichen Membran in Wellen aus. Der große Maßstab des Musters (die Wellenlängen betragen 50–100 μm) ermöglicht eine genaue Analyse der Min-Dynamik. Nachdruck mit Erlaubnis von Nat. Struct. Mol. Biol., Copyright (2011) [12].
  • Dipl. Phys. Jakob C. Schweizer, Biotechnologiezentrum, Technische Universität Dresden

Die Geschichte der Zell- und Molekularbiologie ist, was die Entdeckung und Analyse immer kleinerer Strukturen und Prozesse anbetrifft, durch einen Wettlauf zwischen biologischen Herausforderungen und ihren technischen Lösungen gekennzeichnet. Lange Zeit haben Fortschritte in der Mikroskopie mit den wissenschaftlichen Fragestellungen Schritt gehalten.

Da aber grundlegende physikalische Gesetze nicht einfach außer Kraft gesetzt werden können, müssen geeignete Instrumente immer komplexer werden, wenn die moderne Biologie aufgrund technischer Begrenzungen nicht einfach zum Stillstand kommen soll. Ein markantes Beispiel: um biologische Materie räumlich und zeitlich genauer zu untersuchen, hat man vor kurzem die Auflösung der optischen Mikroskopie jenseits des Beugungslimits dramatisch gesteigert.

Aber ist es wirklich immer notwendig, unsere Technologie an die tatsächlichen Dimensionen biologischer Materie anzupassen, wenn wir fundamentale Mechanismen verstehen wollen? Wir wissen, dass Biologie auf verschiedenen Skalen funktioniert. Warum gehen wir dann nicht her und versuchen, biologische Phänomene direkt zu vergrößern anstatt optisch höher aufzulösen?

Vergrößerung

1989 kam der Film „Liebling, ich habe die Kinder geschrumpft“ heraus, in dem ein glückloser Wissenschaftler eine Maschine entwickelt und aus Versehen seine eigenen Kinder und die der Nachbarn auf die Größe von Insekten schrumpfen lässt. 1992 wurde eine Fortsetzung mit dem Titel „Liebling, jetzt haben wir ein Riesenbaby“ produziert. Diesmal nämlich vergrößert der glücklose Wissenschaftler mit Hilfe einer neuen Erfindung seinen zweijährigen Sohn zu einem 34 m großen Riesen, der Los Angeles in Godzilla-Manier in Angst und Schrecken versetzt.

Warum wenden wir dieses Konzept nicht auf die Zell- und Molekularbiologie an, wenn die Struktur oder der Prozess, für die wir uns interessieren, zu klein ist, um mit den Mitteln der modernen Mikroskopie beobachtet zu werden? Warum vergrößern wir dann nicht einfach das Phänomen, anstatt uns ständig um eine bessere optische Auflösung zu bemühen? Ist das möglich? Ja, es ist unter gewissen Bedingungen möglich, und der Schlüssel dazu scheint in der synthetischen Biologie zu liegen.

Rafts und Membrandomänen

Ein Beispiel: In den letzten zehn Jahren haben Membran-Rafts viel Aufmerksamkeit bei den Zellbiologen erzeugt.

Bis Mitte der Neunzigerjahre betrachtete man die Zellmembran allgemein als eine homogene Flüssigkeit, in der Membranproteine eingebettet sind. Diese Ansicht wurde 1997 durch Simons und Ikonen [17] und in den Jahren danach durch eine Lawine aufeinanderfolgender Forschungsarbeiten in Frage gestellt [7, 10]. Gemäß der „Raft- Hypothese” organisieren sich Lipide in Domänen innerhalb der Plasmamembran, wobei sich die physikalischen Eigenschaften, dieser Domänen vom Rest der Membran unterscheiden (Abb. 1a).

Zu diesen physikalischen Eigenschaften zählen zum Beispiel Lateralfluidität, Oberflächenspannung und Dicke der Doppelschichtstruktur. Vermutlich spielen diese Domänen oder Rafts beim Binden und der Funktionskontrolle von Membranproteinen eine wichtige Rolle. Die Raft-Hypothese ist heutzutage mehr oder weniger akzeptiert, jedoch mit dem Schönheitsfehler, dass Rafts bisher noch nicht direkt in vivo beobachtet wurden.

Viele Experimente weisen auf ihre Existenz hin. Aber bislang konnten sie noch nicht mikroskopisch nachgewiesen werden. Wahrscheinlich wird das auch auf längere Sicht noch nicht möglich sein, da sich Rafts vermutlich im Bereich weniger Nanometer organisieren und eine sehr kurze Lebensdauer haben. Es werden große Bemühungen unternommen, diese durch andere Mittel als durch die optische Mikroskopie sichtbar zu machen oder ihre Existenz indirekt nachzuweisen. Eine Alternative dazu bestünde darin, diese Rafts auf eine Größe auszudehnen, so dass sie mit standardmäßiger Fluoreszenz-Mikroskopie untersucht werden könnten.

Dies scheint möglich zu sein, wenn man die in vivo-Welt verlässt und das Gebiet der synthetischen Biologie minimaler Systeme betritt [16]. Ahmt man die Zellmembran durch künstliche Membranen nach, die eine spezifische Raft-ähnliche Lipidzusammensetzung enthalten, zeigt sich eine Phasentrennung der Lipiden in Domänen auf der Mikrometer-Skala (Abb. 1b). Diese Domänen sollen die synthetischen funktionellen Geschwister der in Zellen vermuteten Rafts sein. Noch wichtiger ist jedoch, dass sie sich durch ihre tatsächliche Sichtbarkeit unter dem Fluoreszenz-Mikroskop auszeichnen.

Solche künstlichen Membranen nennenswerter Größe erhält man beispielsweise durch substratgebundene Lipiddoppelschichten, indem kleine unilamellare Vesikel (SUVs) auf einem hydrophilen Träger wie Glas oder Glimmer fusionieren [18]. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dehydrierte Lipidfilme in Anwesenheit von Wechselstrom zu rehydrieren, sodass sich sogenannte unilamellare Riesenvesikel bilden (GUVs), die als eine ganz grobe in vitro-Annäherung an die biologische Zellmembran betrachtet werden können: eine Membrandoppelschicht trennt einen Innenraum von der Umgebung ab und liefert dadurch die wesentlichen Abgrenzungsbedingungen für eine Organellen-ähnliche Funktion [2], [19]. Die Möglichkeit, Domänen in solchen Zellmembran-ähnlichen Systemen sichtbar zu machen, führte zu tiefergehenden Erkenntnissen über die Merkmale und Funktionen der hypothetischen Rafts [3], [4], [6].

Min-Proteine für die Auswahl der Teilungsregion

Ist diese Anwendung, die Vergrößerung molekularer Mechanismen von der nanoskopischen auf die mikroskopische Ebene durch Transformation von zellulären Prozessen in die synthetische Biologie, ein Einzelbeispiel oder kann dieses Konzept auch auf andere biologische Probleme übertragen werden, wie z. B. auf grundlegende Probleme wie Struktur und Musterbildung? Ein weiteres aussagekräftiges Beispiel, wie Membran-bezogene Prozesse, die sich der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie entziehen, durch synthetische Biologie leicht in vivo abgebildet und untersucht werden können, ist die Vergrößerung von oszillatorischen Prozessen, die der Zellteilung von Bakterien vorausgehen.

Bei Escherichia coli wird die Zellteilung durch den sogenannten Z-Ring eingeleitet, der sich in der Zellmitte zwischen den beiden zukünftigen Tochterzellen bildet [5]. Die Ausformung dieses Z-Rings an einer zentralen Position der Zelle wird wiederum durch eine andere Proteingruppe, die Min-Proteinfamilie, reguliert, die zwischen den Zellpolen oszilliert, aber im Zentrum der Zelle eine minimale Konzentration aufweist (Abb. 2). Die Zellteilung in der Mitte der Zelle ist für eine erfolgreiche Replikation ausschlaggebend.

Es wurde nachgewiesen, dass die Deletion des entsprechenden Min-Genoms bei E.coli-Mutanten zur Zellteilung in anderen potenziellen Teilungsregionen wie zum Beispiel den polaren Zellkappen führt, was wiederum die Bildung nicht-replizierender und DNA-armer Mini-Zellen zur Folge hat [1]. Die Min-Protein-Familie besteht aus drei Proteinen: MinC, MinD und MinE. MinC ist der eigentliche Inhibitor für die Membranbindungsfähigkeit des ZRings. Die Bindung von MinC an die Membran wird wiederum durch kooperative Bindung von MinD und MinE an die Membran reguliert. Durch die Aufnahme von ATP bindet MinD an die Zellmembran und MinE wiederum bindet an das Membran-gebundene MinD.

Nach der ATP-Hydrolyse lösen sich beide Proteine wieder von der Membran (Abb. 3). Dieses kooperative Verhalten verursacht ein oszillierendes Bindungsverhalten der Min-Proteine an die innere Membran der E. coli und kann in vivo mittels Fluoreszenzmarkierung der Proteine beobachtet werden [9], [13], [14]. Aufgrund der geringen Größe der Bakterienzellen von etwa 1–2 μm war es bisher unmöglich, genauere mechanistische Einblicke in die dynamische Interaktion der beteiligten Proteine in vivo zu erhalten.

Von kleinen Oszillationen zu großen Wellen

Wir konnten nachweisen, dass das sich selbst organisierende Min-Proteinsystem in eine künstliche Umgebung transferiert werden kann [11]. Min-Proteine zeigten nicht nur dynamische Bindungsmuster in Form von ebenen Wellen auf substratgebundenen Lipiddoppelschichten, sondern gleichzeitig erhöhte sich die Dynamik im Vergleich zur Zellumgebung um das 20fache. Auf den künstlichen Membranen hatten die Proteinwellen daher eine Wellenlänge von ungefähr 50–100 μm verglichen mit 1–2 μm in den Zellen (Abb. 2 und Abb. 4).

Dieser Anstieg der Dynamik ermöglichte uns ein deutlich detaillierteres Studium des kooperativen Bindungsverhaltens der Min-Proteine, als dies in in vivo-Untersuchungen möglich gewesen wäre. Ein angenehmer Aspekt der synthetischen Biologie von Minimalsystemen besteht darin, dass man Systeme mit unterschiedlichen Kombinationen der Komponenten entwerfen kann.

Wir konnten zum Beispiel beweisen, dass für den Aufbau eines dynamischen Proteinmusters lediglich vier Komponenten notwendig sind: eine Membran, MinD, MinE und ATP. MinC selbst ist für die Inhibierung der Z-Ring-Ausformung in unerwünschten Regionen nötig, aber für die räumliche Positionierung durch die Oszillation wird es nicht gebraucht.

Schlussfolgerungen

Insgesamt erzielten wir durch die Kombination eines synthetischen „bottom up”-Ansatzes eines biologischen Phänomens kombiniert mit Einzelmolekültechniken ein besseres mechanistisches Verständnis für den Prozess. Das heißt, dass das MinD-Bindungsmuster durch eine kontinuierliche Migration des Anbindens von MinD an die Membran gesteuert wird, während sich MinE am hinteren Rand durch schnelles (quasi prozessives) Wiederanbinden an zuvor losgelöste MinE-Proteine ansammelt. Ganz am Ende der Welle sinkt die MinDOberflächenkonzentration an der Membran ab.

Aber jedes MinD-Dimer scheint nun von einem MinE-Dimer besetzt zu sein. Die Hinzufügung von MinC zu dem System brachte weitere Erkenntnisse hinsichtlich der Kooperativität des Systems. Unser Minimalsystemansatz erlaubte erstmals die gleichzeitige Beobachtung aller drei Proteine in Aktion. Wir konnten beweisen, dass MinE für die Ablösung von MinC erforderlich ist. Eine Analyse der Wellenprofile zeigte, dass MinC eigentlich nicht gemeinsam mit MinD und MinE abgelöst wird, sondern dass MinE tatsächlich MinC von MinD verdrängt.

Es ist ersichtlich, dass das Konzept der synthetischen Biologie von Minimalsystemen gewisse Kompromisse mit der biologischen Realität voraussetzt. Nachdem nun die zentralen Mechanismen auf Molekularebene in einem extrem reduzierten System erkannt sind, liegt die Herausforderung nun darin, wieder eine physiologischere Situation anzugehen. Im rekonstruierten Min-System liegt unser Hauptaugenmerk nun auf der räumlichen Begrenzung des Min-Proteinsystems, also ähnlich der Situation in einer Einzelzelle.

Derzeit erforschen wir den Effekt räumlicher Begrenzung auf die Entstehung und das Verhalten von Min- Proteinwellen in 2D und sogar in 3D. Unser Ziel ist es, Proteinwellen nicht nur zu reproduzieren und ihre Reaktion auf externe Begrenzungen festzustellen, sondern auch echte Proteinoszillationen in geschlossenen Räumen nachzuahmen. Angesichts der Tatsache, dass die Wellenlänge von Min-Proteinwellen in unserem in vitro-Versuch etwa 50-mal größer ist als die ihrer zellulären Gegenstücke, können wir geschlossene Räume („closed volumes“) verwenden, die unter dem Mikroskop immer noch gut sichtbar sind.

Wir kommen zu dem Schluss, dass ein solcher Ansatz mit synthetischen Minimalsystemen sicherlich nicht allgemein für die Vergrößerung von Prozessen, die sich der optischen Mikroskopie in vivo entziehen, angewendet werden kann. Nichtsdestoweniger erschließt die synthetische Biologie tatsächlich neue Strategien für die quantitative Untersuchung biologischer Prozesse. Unter anderem sollte man die Möglichkeit, dynamische Prozesse und Strukturen in einem anderen Maßstab darzustellen, zumindest einmal in Betracht ziehen.

Literatur

[1] Adler H. I. et al.: PNAS 57, 321–326 (1967)

[2] Angelova M. I. and Dimitrov D. S.: Faraday DiscussChem Soc 81, 303–311 (1986)

[3] Bacia K. et al.: Biophys. J. 87, 1034–1043 (2004)

[4] Bagatolli L. A. and Gratton E., Biophys. J. 78, 290–305 (2000)

[5] Bi E. F. and Lutkenhaus J.: Nature 354, 161– 164 (1991)

[6] Chiantia S. et al.: Chemphyschem 7, 2409– 2418 (2006)

[7] Elson E. L. et al.: Annu. Rev. Biophys. 39, 207– 226 (2010)

[8] Hale C. A. et al.: J. Biol. Chem. 278, 28109– 28115 (2003)

[9] Kruse K.: Biophys. J. 82, 618–627 (2002)

[10] Lingwood D. and Simons K.: Science 327, 46– 50 (2010)

Für weitere Referenzen kontaktieren Sie bitte die Autoren.

Kontakt 

Dipl. Phys. Jakob C. Schweizer

Prof. Dr. Petra Schwille

Technische Universität Dresden

Biotechnologiezentrum

Dresden

jakob.schweizer@biotec.tu-dresden.de

www.biotec.tu-dresden.de/cms

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