Systembiologie x-trem

Von der Grundlagenforschung zur Anwendung in hyperthermophilen Archaea

  • Abb. 1: Heiße Schwefel Quellen bei Furnas auf São Miguel der größten Insel der Azoren. Hier finden sich thermoacidophile Vertreter der Archaea, die bei pH-Werten um 2 und Temperaturen um 90 °C wachsen können.Abb. 1: Heiße Schwefel Quellen bei Furnas auf São Miguel der größten Insel der Azoren. Hier finden sich thermoacidophile Vertreter der Archaea, die bei pH-Werten um 2 und Temperaturen um 90 °C wachsen können.
  • Abb. 1: Heiße Schwefel Quellen bei Furnas auf São Miguel der größten Insel der Azoren. Hier finden sich thermoacidophile Vertreter der Archaea, die bei pH-Werten um 2 und Temperaturen um 90 °C wachsen können.
  • Abb. 2: Potential der Archaea als Quelle für Extremozyme sowie als Designerstämme für biotechnologische Anwendungen und Prozessoptimierung
  • Abb. 3: Vergleichende Darstellung des klassischen Entner Doudoroff (ED) Weges wie er aus Bacteria bekannt ist und des modifizierten ED-Weges aus Sulfolobus und anderen Archaea. Der modifizierte archaeale ED-Weg ist verzweigt und besteht aus einem nicht-phosphorylativen Zweig (npED) und dem semi-phosphorylativen Zweig (spED). Die Nettoenergieausbeute beider Wege, sowie die herausforderung des Stoffwechsels bei hoher Temperatur durch thermolabile Intermediate (markiert durch rote Sterne) und die spezielle Anpassung auf Enzymebene ist gezeigt (Details s. Text, bzw. Referenz [1]). Abkürzungen: 6PGD, 6-Phosphoglukonat Dehydratase; ENO, Enolase; G6PDH, Glucose- 6-Phosphat Dehydrogenase; GAD, Glukonat Dehydratase; GAOR, Glycerinaldehyde:Ferredoxin Oxidoreduktase; GAPDH, Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (phosphorylierend); GAPN, nicht-phosphorylierende GAPDH; GDH, Glukose Dehydrogenase; GK, Glycerat Kinase; GLK, Glucokinase; HK, Hexokinase; KDGK, 2-Keto-3-deoxyglukonat Kinase; KDPGA, 2-Keto-3-deoxy-6-phosphoglukonate Aldolase; KD(P)GA, 2-keto-3-deoxy-(6-phospho)glukonate Aldolase; PGK, Phosphoglycerat Kinase; PGAM, Phosphoglycerat Mutase); PK, Pyruvat Kinase; G6P, Glukose 6-phosphat; GAP, Glycerinaldehyde 3-phosphate; 1,3BPG, 1,3-Bisphosphoglycerat; 3PG, 3-Phosphoglycerat; 2PG, 2-Phosphoglycerat; PEP, Phosphoenolpyruvate; KDG, 2-Keto-3-deoxyglukonate; KDPG, 2-Keto-3-deoxy-6-phosphoglukonate; GA, Glycerinaldehyd.

Sytembiologie: Basierend auf Sequenzvergleichen der rRNA der kleinen ribosomalen Untereinheit wurde gezeigt, dass die Archaea neben den Bacteria und Eukarya eine von drei evolutiven Hauptlinien, die sog. Domänen, repräsentieren, in die alle lebenden Organismen gruppiert werden. Archaea besitzen einen Mosaikcharakter aus archaeaspezifischen sowie eukaryotischen und bakteriellen Merkmalen.

Archaea
So ähneln die Mechanismen der Informationsverarbeitung wie z.B. die Replikation, Transkriptions- und Translationsmaschinerie vereinfachten Versionen der eukaryotischen Homologen. Demgegenüber ähnelt die prokaryotische Zellorganisation und die Struktur der DNA mit einem einzelnen zirkulär geschlossenen Chromosom, in Operon-Strukturen organisierten Genen und dem Vorhandensein von Plasmiden eher den Bacteria. Einzigartig für Archaea ist neben der Zellwandstruktur insbesondere die Beschaffenheit der Cytoplasmamembran, die aus Di- oder Tetraetherlipiden mit Isoprenoid-Seitenketten zusammengesetzt ist, anstatt der für Bakterien und Eukarya typischen Phospholipide (Glycerolester mit Fettsäureseitenketten). Auch stoffwechselphysiologisch weisen die Archaea einige spezifische Besonderheiten auf wie z. B. die Fähigkeit der methanogenen Vertreter durch Methan-Produktion Energie zu gewinnen. Insgesamt zeichnen sich die Archaea durch eine große Stoffwechselkomplexität aus, die mit der der Bakterien und niederen Eukarya vergleichbar ist. Interessanter Weise fehlen den Archaea aber viele der „klassischen" von Bacteria und Eukarya bekannten Stoffwechselwege wie z. B. ein vollständiger Pentose-Phosphat Weg zur Synthese von Pentosen. Im zentralen Kohlenhydratmetabolismus fehlen insbesondere auch die „klassischen", von Bacteria und Eukarya bekannten Zuckerabbauwege, der Embden-Meyerhof-Parnas- (EMP) und der Entner-Doudoroff (ED) Weg. Stattdessen wurden für Archaea einzigartige Modifikationen dieser Wege beschrieben, wobei die Modifikationen weniger die chemischen Reaktionen und Stoffwechselintermediate selbst betreffen, die oft unverändert sind. Vielmehr sind es die beteiligten Biokatalysatoren, die Enzyme, die in vielen Fällen keine Ähnlichkeiten zu den Enzymen der „klassischen" Wege zeigen [1].

Dabei führt die Verwendung dieser ungewöhnlichen „neuen" Enzyme zusätzlich zu Veränderungen ihrer regulatorischen Eigenschaften. Diese Stoffwechseldiversität der Archaea bietet ein einzigartiges Potential für die Biotechnologie, das „Metabolic engineering" und die synthetische Biologie, das bisher kaum erschlossen ist.

Extremophile
Wenngleich mittlerweile durch molekulare Analysen immer offensichtlicher wird, dass Archaea auch in mesophilen Habitaten ähnlich weit und ubiquitär verbreitet und z.B. für die globalen Stoffkreisläufe ebenso bedeutend sind wie Bacteria, so sind doch viele der bekannten, kultivierbaren Vertreter der Archaea sog. „Extremophile", die Habitate mit extremen Temperaturen, pH-Werten oder Salzkonzentrationen besiedeln. Interessanter Weise bilden hyperthermophile Organismen (optimale Wachstumstemperatur über 80 °C), die sowohl in der Domäne der Archaea als auch in der Domäne der Bacteria vorkommen, im 16S/18S rRNA basierten phylogenetischen Stammbaum die Basis, was auf einen Ursprung des Lebens unter hyperthermophilen Bedingungen hinweist. Vergleichende Untersuchungen (hyper)thermophiler Archaea, als ursprüngliche Vertreter der dritten Hauptentwicklungslinie, können daher wichtige Informationen über phylogenetische Zusammenhänge liefern.

Hier wird der zentralen Kohlenhydrat Metabolismus in hyperthermophilen Archaea untersucht. U. a. anhand der crenarchaealen Modell-Oganismen Sulfolobus solfataricus und S. acidocaldarius wird die Komplexität der metabolen Netzwerke, deren Regulation sowie die Reaktionen auf äußeren Stress, wie z. B. suboptimale Temperaturen, auf Systemebene analysiert.

S. solfataricus und S. acidocaldarius wurden ursprünglich aus terrestrischen vulkanischen Habitaten nahe Neapel in Italien bzw. im Yellowstone Nationalpark in den USA isoliert. Als thermoacidophile Organismen wachsen beide Sulfolobus Spezies optimal bei Temperaturen um 80 °C und extrem sauren pH-Werten von 2 - 4. Sie eignen sich als archaeale Modellorganismen, weil die Genomsequenzen bekannt und Systeme zur genetischen Manipulation etabliert sind. Beide Vertreter der Sulfolobales sind metabol sehr vielseitige, heterotrophe Aerobier und können im Labor leicht auf einer Vielzahl von Substraten, insbesondere Kohlenhydraten, als Kohlenstoff- und Energiequelle kultiviert werden.

Der Stoffwechsel
Im zentralen Kohlenhydratmetabolismus von Sulfolobus wird Glukose über einen modifizierten Entner-Doudoroff (ED)-Weg abgebaut, den sogenannten verzweigten ED-Weg, der sich vom klassischen, aus Bacteria bekannten ED-Weg dadurch unterscheidet, dass Glukose nicht initial phosphoryliert sondern direkt zum Glukonat oxidiert und weiter zum 2-keto-3-deoxyglukonat (KDG) dehydratisiert wird (Abb.2). Auf der Stufe des Schlüsselintermediates KDG verzweigt sich der modifizierte Weg: KDG wird entweder im semi-phosphorylativen (sp) Zweig zu 2-keto-3-deoxy-6-phospho-Glukonat (KDPG) phosphoryliert und anschließend in Glycerinaldehyd 3-Phosphat (GAP) und Pyruvat gespalten oder aber im nicht-phosphorylativen (np) Zweig direkt zu Glyceraldehyd (GA) und Pyruvat umgesetzt. Beide Zweige werden dann auf der Stufe des 2-Phosphoglycerates (2PG), das sowohl im spED aus 3PG und im npED über Glycerat aus GA gebildet wird, wieder zusammengeführt. 2PG wird dann über Phosphoenolpyruvat schließlich zu einem weiteren Molekül Pyruvat abgebaut. Ein wesentlicher Unterschied dieses verzweigten ED-Weges im Vergleich zum klassischen ED-Weg ist das Fehlen der zweistufigen Umsetzung von GAP über 1,3-Bisphosphoglycerat zu 3-Phosphoglycerat, die von der phosphorylierenden Glyceraldehyde-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH) und Phosphoglycerate Kinase (PGK) katalysiert wird und mit der ATP-Synthese über den Mechanismus der Substratstufenphosphorylierung gekoppelt ist. Stattdessen wird im npED Zweig GAP in einem Schritt über die nicht-phosphorylierende Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (GAPN) direkt zu 3PG oxidiert und im npED Zweig GA direkt zu Gylcerat oxidiert und dann erst phosphoryliert. Im Gegensatz zur GAPDH/PGK Reaktion im klassischen ED-Weg werden beide Oxidationsreaktionen nicht mit der ATP-Synthese über Substratstufenphosphorylierung gekoppelt. Damit wird, statt 1 mol ATP pro mol Glukose im klassischen ED-Weg, im modifizierten, verzweigten ED-Weg der thermoacidophilen Archaea netto kein ATP gebildet (Abb.2). Lange wurde als Erklärung für diese Modifikation lediglich angenommen, dass der Verlust von einem ATP insbesondere unter aeroben Bedingungen nicht sonderlich ins Gewicht fällt, da die Energie hauptsächlich in der Atmungskette via Elektronentransportphosphorylierung bereit gestellt wird.

Anpassung an extreme Bedingungen
Im Rahmen des transnationalen BMBF geförderten Projektes „Sulfosys Biotec" wurde jetzt in einem integrierten systembiologischen Ansatz, der moderne Poly-omics Methoden und Modellierungen mit klassisch mikrobiologischen und biochemischen Untersuchungen kombiniert, gezeigt, dass v.a. die Triosephosphat Intermediate Dihydroxyacetonphosphat, GAP und 1,3-BPG thermolabil sind und diese Instabilitäten unter thermophilen Bedingungen für die Organismen eine erhebliche Herausforderung darstellen. Wie auf biochemischen Daten basierende Modellierungsvohersagen sowie in vitro Rekonstitution ergaben, verursacht der thermische Zerfall dieser Intermediate in bisher nicht identifizierte Abbauprodukte einen erheblichen Verlust an Kohlenstoff aus dem in vitro System. Weiterhin sprechen die Modellierungsergebnisse dafür, dass durch die thermische Degradation von 1,3 BPG zu 3PG unter glykolytischen Bedingungen in Gegenwart der Phosphoglyceratkinase, die das thermisch entstandene 3PG wieder zu 1,3BPG phosphoryliert, ein „futile cycle" (=nutzloser Substratzyklus) entsteht. Das würde letztlich zu einer kontinuierlichen Spaltung von ATP und damit zu einem erheblichen Verlust an Energie führen. Wie detailliertere Analysen nahe legen, können die Modifikationen im verzweigten ED-Weg für den Glukose-Abbau in Sulfolobus als Antwort auf diese Herausforderungen angesehen werden. Zum einen wird die katabole Bildung von 1,3BPG im spED Zweig durch die irreversible GAP-Oxidation über die nicht-phosphorylierende GAPN direkt zum relativ stabilen 3PG bzw. im npED Zweig durch die direkte Oxidation von GA und die Bildung von 2PG umgangen. Zum anderen wird durch veränderte Feinregulation des Metabolimus mit anabol aktiver GAPDH und PGK die 1,3BPG Bildung aus 3PG und damit ein „futile cycling" zusätzlich minimiert und damit ein erheblicher Energieverlust unter thermophilen Bedingungen umgangen. Die verglichen mit dem klassischen ED-Weg verringerte ATP-Ausbeute des modifizierten ED-Weges wird also durch die Verhinderung von Kohlenstoff- und Energieverlusten unter thermophilen Bedingungen aufgewogen, so dass diese Modifikation auch als ein Mechanismus der metabolen Thermoadaptation verstanden werden kann [1, 2]. Während über die Thermostabilisierung von Makromolekülen und Zellbestandteilen wie Membranen mittlerweile relativ viele Untersuchungen existieren, behandeln diese Arbeiten erstmals die Adaptierung (hyper)thermophiler Organismen an thermische Instabilitäten von niedermolekularen Stoffwechselintermediaten.

Anwendungen
Das Verständnis der archaealen Stoffwechselkomplexität auf Systemebene trägt dazu bei, Archaea für biotechnologische Anwendungen nutzbar zu machen. Neuartige archaeale Stoffwechselwege und die daran beteiligten, ungewöhnlichen Enzyme mit oftmals neuen regulatorischen Eigenschaften bergen großes Potential für die Entwicklung neuer und die Verbesserung bestehender Anwendungen. Gerade „Extremophile" insbesondere (Hyper)thermophile, und aus ihnen gewonnene Biokatalysatoren, sog. „Extremozyme", haben mit ihrer hohen Toleranz z. B. gegenüber hohen Temperaturen und/oder Säure nicht selten verbunden mit Lösemittelresistenz große Vorteile. So können sie den harschen Bedingungen industrieller Prozesse widerstehen bzw. benötigen diese Bedingungen sogar für optimale Aktivität. Hohe Temperaturen sind in industriellen Syntheseprozessen zudem oftmals vorteilhaft: Zum einen kann dadurch das chemische Gleichgewicht in Richtung der Produktsynthese und damit erhöhter Ausbeuten verschoben werden und zum anderen sind bestimmte Ausgangsstoffe unter hohen Temperaturen überhaupt erst löslich. Schließlich wird die Produktreinigung durch simultane Verflüchtigung bzw. Destillation ermöglicht bzw. erleichtert und so andernfalls aufwendige Prozessführungen vermieden. Nicht zuletzt bietet das Arbeiten mit hyperthermophilen Proteinen auch experimentelle Vorteile im Vergleich zu mesophilen Homologen (z.B. eine höhere Rigidität, leichtere Kristallisation, einfache Aufreinigung rekombinanter Proteine durch Hitzefällung, Verringerung der Kontaminationsgefahr durch hohe Temperaturen).

Im AK Siebers werden in mehreren Projekten (SulfoSYSBiotec (http://www.sulfosys.com/) und ExpresSYS (http://genomik-transfer.de/index.php?section=verbund&fkz=0315586) BMBF gefördert; Hotzyme gefördert von der EU (http://hotzyme.com/)) einige vielversprechende Ansätze für den Transfer von Ergebnissen aus der Grundlagenforschung zur Stoffwechselkomplexität und Biodiversität von Archaea in die Entwicklung nachhaltiger, ökoeffizienter Anwendungen verfolgt. Im Verbundprojekt Expressys wird an der Etablierung von S. acidocaldarius als alternativem Expressionswirt gearbeitet und auch für den Einsatz von Enzymen aus dem zentralen Kohlenhydratmetabolismus konnten erste Erfolge bei der Entwicklung von Syntheseverfahren für Feinchemikalien verzeichnet werden [3]. Das unterstreicht, dass Archaea, obwohl diesbezüglich bisher weitgehend unbeachtet, ein beachtliches Reservoir an Bausteinen für die Entwicklung nachhaltiger Prozesse in der Biotechnologie bereitstellen und so neue Horizonte für „Metabolic Engineering" und Synthetische Biologie eröffnen.

Literatur
[1] Bräsen C. et al.: Microbiol Mol Biol Rev 78: 89-175 (2014)
[2] Kouril T. et al.: FEBS J 280(18):4666-80 (2013)
[3] Matsubara K. et al.: J Biotech, http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.06.005 (2014)

Kontakt
Dr. Christopher Bräsen
Prof. Dr. Bettina Siebers
Molekulare Enzymtechnologie und Biochemie
Biofilm Centre, Universität Duisburg-Essen
bettina.siebers@uni-due.de

Weitere Beiträge zum Thema: http://www.git-labor.de/category/tags/biokatalyse
Mehr Informationen:
http://www.sulfosys.com/
http://genomik-transfer.de/

 

Autor(en)

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Universitätsstr. 5-7
45141 Essen
Telefon: 0201/183-0

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