Transparente Folien aus Spinnenseide

  • Abb. 1: Farblose SpinnenseidenfolieAbb. 1: Farblose Spinnenseidenfolie
  • Abb. 1: Farblose Spinnenseidenfolie
  • Abb. 2: Aufbau eines typischen Spinnenseidenproteins. Die Grundbausteine von Spinnenseide sind kurze Motive bestehend aus wenigen Aminosäuren. Wiederholungen von mehreren, teils unterschiedlichen, Motiven ergeben ein Modul.
  • Abb. 3: Herstellung und Struktur von Spinnenseidenfolien
  • Abb. 4: Die kovalente Modifikation von Folien ermöglicht hingegen eine dauerhafte Verbindung zwischen Folie und chemischem Molekül bzw. Enzymen.

Transparente Folien aus Spinnenseide. Seit jeher verwenden Spinnen Seide zum Netzbau, um Beute zu konservieren, zum Schutz des Nachwuchs, und für vieles mehr. Dabei nutzen Sie die herausragenden Materialeigenschaften der Seide, um hochkomplexe und stabile Strukturen zu fertigen, die in Natur und Technik ihresgleichen suchen. Interessanterweise wird Spinnenseide in der freien Natur fast ausschließlich in Fadenform eingesetzt. Dabei bietet das Material an sich ein weitaus breiteres Spektrum an möglichen Assemblierungsformen. Von besonderem Interesse ist beispielsweise die Umwandlung von Seidenproteinen (Spinnenseide besteht zu fast 100 % aus Proteinen) in transparente Filme (Abb. 1). Diese Filme sind glasklar und haben neben einer Beschaffenheit, welche mit denen von Kunststofffolien vergleichbar ist, weitere positive Eigenschaften. Dieser Artikel zeigt, wie heutzutage Spinnenseide nach dem natürlichen Vorbild im Labor hergestellt werden kann, und wie daraus Seidenfilme mit neuen Eigenschaften gewonnen werden.

Spinnenseide ist ein faszinierendes Naturmaterial [1]. Seit Jahrmillionen wurde das Material durch unzählige Schritte in der Evolution optimiert und an die jeweiligen Bedingungen angepasst. Dadurch entstand ein Biomaterial, dass vielen synthetisch hergestellten Fasern weit überlegen ist. Spinnenseide zeigt eine hohe Stabilität in Kombination mit einer außergewöhnlichen Dehnbarkeit. Dies resultiert in einer sehr hohen Zähigkeit und einer maximalen Bruchenergie, die 3 – 5 mal höher ist als beispielsweise bei Aramidfasern (z. B. Kevlar). Ein Spinnennetz besteht aus mehreren unterschiedlichen Arten von Spinnenfasern.

Die Rahmenkonstruktion ist aus einem stabilen und vergleichsweise wenig dehnbaren Faden aufgebaut, der eine hohe Stabilität und Steifigkeit des Netzes gewährleistet. Die Fangspirale ist hingegen aus einer Faser konstruiert, die extrem dehnbar ist und so Beute aufhalten kann ohne sie dabei zu beschädigen. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass weder die Rahmenseide noch die Fangspiralseide von sich aus klebt. Die klebrige Substanz, an der z. B. Fluginsekten hängen bleiben, wird erst in einem zweiten Arbeitsschritt nachträglich auf die Fangspirale (und nicht an die Rahmenkonstruktion) angebracht.

Der strukturelle Aufbau von Spinnenseide

Das Biomaterial Spinnenseide ist fast ausschließlich aus Proteinen aufgebaut [1][2].

Je nach Seidenart können dies Proteine eines einzigen Typs oder eine Kombination aus 2–3 unterschiedlichen Proteinen sein. Die Rahmenseide der europäischen Gartenkreuzspinne Araneus diadematus besteht beispielsweise aus zwei unterschiedlichen Seidenproteinen, ADF-3 und ADF-4. Eine Untersuchung dieser Proteine auf molekularer Ebene zeigte einige für Proteine ungewöhnliche Eigenschaften:

Zum einen sind Seidenproteine aus vielfach wiederkehrenden Modulen aufgebaut (Abb. 2). Die einzelnen Module bestehen dabei aus wenigen Aminosäuren (ca. 10 – 50) und können in einem einzelnen Protein bis zu 100mal wiederholt werden. Zusätzlich hat z. B. ADF-4 vergleichsweise kurze nicht-repetitive Bereiche, die sich an den beiden Enden des Proteins befinden.

Ungewöhnlich ist weiterhin, dass Seidenproteine in wässriger Lösung kaum strukturelle Anteile besitzen. Im Gegensatz dazu haben die meisten Proteine, die in Zellen als Enzyme oder in anderer Funktion tätig sind, in Lösung eine definierte dreidimensionale Struktur, die essentiell für die Funktionalität des jeweiligen Proteins ist. Spinnenseidenproteine liegen fast vollständig entfaltet vor und bilden erst beim Assemblieren (Zusammenlagern) in den Fäden Sekundär- und Tertiärstrukturelemente aus. Die Assemblierung wird dabei durch verschiedene Faktoren genauestens kontrolliert.

So führt z. B. eine Änderung des pH-Wertes (zusammen mit einem Ionenaustausch) zur spontanen Ausbildung von Sekundärstruktur und zur Aggregation. Aus biologischer Sicht ist dieses besondere Verhalten der Proteine dabei sehr wichtig, da eine vorzeitige Strukturbildung noch im Körper zu einer für die Spinne fatalen Aggregation führen würde. Erst kurz bevor die Seide beim Spinnprozess den Hinterleib der Spinne verlässt assembliert die Seide durch chemische Vorgänge spontan und gewährleistet somit die schnelle Ausbildung des Fadens.

Die außergewöhnlichen Eigenschaften des Spinnenfadens sind vor allem durch die Interaktionen der einzelnen Proteine untereinander im fertigen Faden bestimmt. Kristalline Bereiche, die hauptsächlich aus stabilen ß-Faltblättern bestehen, sind in flexible amorphe Regionen eingebettet. Die unterschiedlichen Strukturen sind dabei durch Peptidbindungen kovalent miteinander verbunden und bilden somit ein stabiles Gerüst. Die kristallinen Bereiche sind im Faden für die enorme Stabilität verantwortlich, die amorphe Matrix ermöglicht dabei gleichzeitig eine hohe Flexibilität und Dehnbarkeit.

Rekombinante Herstellung

Eine Produktion von Spinnenseide im großen Maßstab auf natürlichem Weg ist ineffizient. Die wenigsten Spinnen lassen sich aufgrund ihres territorialen Verhaltens in Gruppen halten. Desweiteren ist die Qualität der natürlichen Spinnenseide stark vom Wohlbefinden und vom Lebensalter der Spinne abhängig. Spinnen, die in Gefangenschaft leben, produzieren meist eine Seide von minderer Qualität. Eine alternative Methode, um an die begehrte Seide zu kommen, ist die rekombinante Produktion von Spinnenseidenproteinen durch fermentative Techniken in Bakterien. Dazu wird die Erbinformation der Spinnenseide analysiert und die Seidenmodule identifiziert.

Nach Anpassung des genetischen Codes der einzelnen Module an eine bakterielle Produktion können diese vervielfältigt und mittels molekularbiologischer Methoden in beliebiger Reihenfolge aneinander gesetzt werden. So erhält man naturähnliche Seidenkonstrukte, die in bakterielle Produktionsstämme transformiert werden können. Für eine technische Produktion von Spinnenseide eignen sich nur spezielle Bakterienstämme, welche keine homologe Rekombination durchführen [3].

Dies ist notwendig, da die hochrepetitive Seidensequenz ansonsten von den Wirtsorganismen verändert werden. Durch den Einsatz dieser geeigneten Stämme können mittels etablierter Fermentationsmethoden in Standard-Bioreaktoren größere Mengen an reinem Spinnenseidenprotein hergestellt werden. Nach Produktion und Aufreinigung der Seidenproteine liegen diese gelöst vor.

Durch den geringen Anteil an Strukturelementen in der gelösten Form ist das Protein relativ unempfindlich gegen äußere Einflüsse wie z. B. erhöhte Temperatur und kann daher effizient gereinigt und ohne großen Aufwand gelagert werden. Das gereinigte Protein kann anschließend durch geeignete Bedingungen/Verfahren in einen Faden assembliert werden. Zusätzlich kann es aber zu anderen dreidimensionalen Formen, wie Schäume, Kapseln oder transparente Filme, verarbeitet werden.

Proteinfilme

Proteinfilme können aus unterschiedlichsten Strukturproteinen hergestellt werden. Diese lagern sich dabei zu Netzwerken zusammen, so dass eine feste, in sich stabile, dreidimensionale (makroskopische) Schicht entsteht. Beispiele hierfür sind z. B. Kollagen – ein natürlicher Baustein von Knorpel, Sehnen und Knochen – Elastin, Zein (in Mais vorkommendes Speicherprotein) oder die Seide des Maulbeer-Seidenspinners [4][5][6].

Die Anwendungen für Proteinfilme reichen dabei von der Nahrungsmittelindustrie (als essbare Verpackung (Zein)), über pharmazeutische Gebiete bis zum medizintechnischen Bereich. Hier werden die Filme aus natürlich vorkommenden Proteinen als Trägermaterial für tissue engineering oder als Wundabdeckung bzw. zur Hautregeneration oder zum Knochenaufbau eingesetzt. Das Anheften und Wachstum von verschiedenen Zelllinien konnte auf Filmen sowohl aus Seide als auch aus Zein oder Kollagen gezeigt werden [4][5][6].

Entscheidend für die genannten Anwendungen sind die Verträglichkeit (Biokompatibilität) der verwendeten Materialien, deren möglichst rückstandsloser Abbau in vivo und die mechanischen Eigenschaften der Filme. In dieser Hinsicht sind Filme aus Spinnenseide von besonderem Interesse, da diese im Gegensatz zu den meisten anderen Proteinfilmen mechanische Eigenschaften aufweisen, die vergleichbar mit herkömmlichen Kunststofffolien sind.

Die Verwendung von biotechnologisch hergestellten Spinnenseidenproteinen bietet darüberhinaus den großen Vorteil, dass diese (im Gegensatz zu aus Naturmaterialien gewonnenen Filmen) genetisch verändert und somit an beliebige Anforderungen angepasst werden können. Weiterhin bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, zusätzliche Effektstoffe (Wachstumsfaktoren, Zelladhäsions-Signale, aber auch Farbstoffe oder antimikrobielle Peptide) direkt und kovalent an entsprechende Filme zu koppeln.

Filmherstellung

Analog zur Herstellung des Fadens, der von der Spinne aus einer hochkonzentrierten Proteinlösung gesponnen wird [1], können Spinnenseiden- Filme aus (verdünnten) Lösungen der entsprechenden Proteine gebildet werden. Diese Lösung wird auf eine Oberfläche gegossen (oder per spin-coating oder dip-coating aufgebracht), wobei über die eingesetzte Protein-Konzentration und das Volumen der Lösung pro Fläche die Dicke des Films genau reguliert werden kann. Diese liegt typischerweise zwischen einigen Nanometern und mehreren Mikrometern. Während die Fadenassemblierung durch eine Änderung der äußeren Faktoren (pH-Wert, Ionenstärke/-zusammensetzung sowie Zugkraft, s. o.) initiiert wird, bildet sich der Proteinfilm durch Evaporation des verwendeten Lösungsmittels aus.

Nach vollständiger Trocknung liegt ein transparenter Film vor, der leicht von der verwendeten Oberfläche abgezogen werden kann. Für die Filmherstellung sind leicht flüchtige, organische Lösungsmittel, wie Hexafluoro-isopropanol (HFIP), Ameisensäure, aber auch Wasser geeignet. Im Gegensatz zu wässrigen Lösungen, in denen Seidenproteine hauptsächlich ungefaltet vorliegen (s. o.), weisen sie in einer HFIP-Lösung Sekundärstruktur-Elemente auf, die sich während der Film-Assemblierung weiter ausbilden.

CD-spektroskopisch konnte gezeigt werden, dass die Proteine in einem aus HFIP gegossenen Film β-helikale Struktur aufweisen (Abb. 3). Solche Filme lassen sich leicht in Wasser wieder auflösen. Um die für viele Anwendungen notwendige Wasserbeständigkeit zu erreichen, können die Filme durch Behandlung mit einer Phosphatlösung oder Alkoholen, wie z. B. Methanol, in einen wasserunlöslichen Zustand überführt werden. Dies geht mit einer Änderung der Sekundärstruktur zu einer β-Faltblatt-reichen Struktur einher.

So behandelte Filme aus dem biotechnologisch hergestellten Analogon zu ADF-4 sind beispielsweise unlöslich in typischen Proteindenaturierungsmitteln wie Harnstoff oder Guanidinium-Hydrochlorid [7][8].

Seidenmodifizierung

Um den Anforderungen spezieller Einsatzgebiete zu entsprechen, können Spinnenseiden-Filme mit unterschiedlichen (auch nicht-natürlichen) Eigenschaften hergestellt werden. Durch die Wahl des Proteins, des Lösungsmittels oder einer besonderen Nachbehandlung können beispielsweise die mechanischen Eigenschaften oder die chemische Stabilität variiert werden [8][9]. Andererseits können bestimmte Stoffe direkt in den Film eingegossen werden, um z. B. farbige Filme zu erhalten (Abb. 4).

Des weiteren besteht die Möglichkeit, reaktive Aminosäuren-Seitenketten (wie Glu, Lys) als spezifische Verknüpfungsstelle zu nutzen, um die Filme spezifisch zu funktionalisieren. Die erfolgreiche Kopplung von Fluoreszenzfarbstoffen und Enzymen in nativer Form wurde bereits gezeigt [7]. Je nach gewünschtem Ergebnis kann dabei die Verknüpfung an die Proteine vor oder nach der Filmassemblierung erfolgen (Abb. 4).

Werden die Proteine in Lösung modifiziert und der Film anschließend gegossen, so ist die Markierung über den ganzen Film verteilt. Eine Kopplung an den bereits gebildeten Film hingegen erlaubt eine gerichtete Modifizierung nur einer Oberfläche. Durch Wiederholen des Vorgangs mit einer zweiten Komponente können so asymmetrisch modifizierte Filme hergestellt werden. Dadurch besteht die Möglichkeit, unzählige Variationen speziell maßgeschneiderter Proteinfilme für spezielle Anwendungen zu designen.

Perspektiven

Filme aus biotechnologisch hergestellten Spinnenseiden-Proteinen bieten breite Anwendungsmöglichkeiten. Sie können zur kontrollierten Freisetzung von Wirkstoffen, als Basismaterial für in vitro Gewebekultivierung oder zur Beschichtung von Implantaten eingesetzt werden. Weitere spezifische Effekte lassen sich durch die Kopplung von zusätzlichen Komponenten erreichen. Ein Film aus einem Spinnenseidenprotein, an das auf genetischen Wege eine spezifische Zelladhäsions-Sequenz angefügt wurde, zeigte so beispielsweise ein verbessertes Zellwachstum [10].

Durch Einfügen bestimmter Abbausignale besteht z. B. auch die Möglichkeit, die Lebensdauer der Filme bzw. die Abbaubarkeit im Körper genau zu regulieren. Neben dem Einsatz im medizinischen Bereich sind Spinnenseiden-Filme mit ihren hervorragenden Eigenschaften zur Beschichtung und Veredelung verschiedenster Materialien geeignet. Die Kombination der inhärenten Eigenschaften von Spinnenseide mit den vielfältigen Modifizierungs- und Anpassungsmöglichkeiten, die sich aus der biotechnologischen Produktion der Proteine ergeben, eröffnet eine Vielzahl an Einsatzgebieten für Spinnenseidenfolien in der Zukunft.

Danksagung

Wir danken Ute Slotta für hilfreiche Anregungen zur Folienpräparation. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Munich Center for Integrated Protein Science (CIPSM) und von der TUM International Graduate School of Science and Engineering (IGSSE) und der DFG.

Referenzen
[1] Römer, L. et al.. Chemie in unserer Zeit 41, 306–314 (2007)
[2] Scheibel, T. et al.. Microbial Cell Factories 3, 14 (2004)
[3] Schmidt M. et al.. Biotech. Letters 29, 1741–1744 (2007)
[4] Furth, M. E. et al.. Biomaterials 28, 5068–5073 (2007)
[5] Sun, Q. et al.. Biopolymers 78, 268 – 274 (2005)
[6] Altman, G. H. et al.. Biomaterials 24, 401– 416 (2003)
[7] Huemmerich, D. et al.. Applied Physics A 82, 219 –222 (2006)
[8] Slotta, U. et al.. Supramolecular Chemistry 18, 465 – 471 (2006)
[9] Junghans, F. et al.. Applied Physics A 82, 253 –260 (2006)
[10] Bini, E. et al.. Biomacromolecules 7, 3139–3145 (2006)

Kontakt:

Dr. Thomas Scheibel
Dr. Lin Römer
Kristina Spieß

Technische Universität München
Garching
Tel.: 089/289-13179
thomas.scheibel@fiberlab.de

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