Tub-tag labeling

Sekundenkleber für Antikörper-Ingenieure

  • Abb. 1: a) Schematische Darstellung des natürlichen, TTL-vermittelten Tyrosinanbaus an den C-Terminus von α-Tubulin. b) Schematische Darstellung der umprogammierten TTL-Reaktion, bei der der Tub-tag auf ein beliebiges Protein (protein of interest, POI) übertragen und ein unnatürliches Tyrosinderivat eingebaut wird. c) Schematische Darstellung der zweistufigen, Tub-tag-vermittelten ortsspezifischen Proteinmarkierung.Abb. 1: a) Schematische Darstellung des natürlichen, TTL-vermittelten Tyrosinanbaus an den C-Terminus von α-Tubulin. b) Schematische Darstellung der umprogammierten TTL-Reaktion, bei der der Tub-tag auf ein beliebiges Protein (protein of interest, POI) übertragen und ein unnatürliches Tyrosinderivat eingebaut wird. c) Schematische Darstellung der zweistufigen, Tub-tag-vermittelten ortsspezifischen Proteinmarkierung.
  • Abb. 1: a) Schematische Darstellung des natürlichen, TTL-vermittelten Tyrosinanbaus an den C-Terminus von α-Tubulin. b) Schematische Darstellung der umprogammierten TTL-Reaktion, bei der der Tub-tag auf ein beliebiges Protein (protein of interest, POI) übertragen und ein unnatürliches Tyrosinderivat eingebaut wird. c) Schematische Darstellung der zweistufigen, Tub-tag-vermittelten ortsspezifischen Proteinmarkierung.
  • Abb. 2: a) Schematische Darstellung der Wirkweise von ADCs. b) Schematische Darstellung unterschiedlicher ADC-Konjugationsmethoden. Die konventionelle, statistische Konjugation verursacht mit großer Wahrscheinlichkeit die Entstehung heterogener Konjugatpopulationen mit unerwünschten Produkten. Ortsspezifische Konjugation erlaubt hingegen eine größere Kontrolle über den Konjugationsprozess.
  • Abb. 3: Schematische Darstellung der Tub-tag-vermittelten Produktion ortsspezifisch konjugierter ADCs.

Die ortsspezifische Markierung von Proteinen ist entscheidend für eine Vielzahl biotechnologischer Anwendungen. Die neuartige chemoenzymatische Methode „Tub-tag labeling“ ermöglicht den hocheffizienten Anbau verschiedenster Funktionalitäten wie Farbstoffe, Proteinstabilisatoren und andere Biomoleküle mithilfe des Enzyms Tubulin-Tyrosin-Ligase (TTL). Unter den vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten der neuen Technologie hat die Herstellung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (Antibody Drug Conjugates, ADCs) für die gezielte und effiziente Behandlung von Krebserkrankungen besonderes Potential.

Chemische und chemoenzymatische ortsspezifische Proteinmodifizierungen

Methoden für die gezielte chemische Modifizierung von Biomolekülen sind leistungsfähige Werkzeuge, die es Forschern erlauben, biologische Funktionen eines bestimmten Proteins in seiner komplexen zellulären Umgebung zu erforschen. So führte die Verknüpfung verschiedenster Biomoleküle mit Fluorophoren oder Biotin zur Entwicklung von leistungsfähigen Biomarkern, die täglich innerhalb der Lebenswissenschaften Verwendung finden. Um jedoch das gesamte Potential chemischer Proteinmodifizierungen ausschöpfen zu können, müssen diese Methoden ortsspezifisch und hocheffizient sein. Zusätzlich darf das zu konjugierende Molekül die Struktur des Proteins nicht beeinflussen. Nur wenn diese Bedingungen erfüllt sind, können homogene Produkte erzielt werden, die die intakte Funktion des Konjugats gewährleisten [1]. Um dieses Ziel zu erreichen wird oftmals eine einzigartige unnatürliche chemische Funktionalität in das Biomolekül eingeführt, die in einem zweiten Schritt selektiv für die Kopplung adressiert werden kann. Der kotranslationale Einbau von unnatürlichen Aminosäuren mit Hilfe von modifizierten Organismen ist hierfür eine besonders elegante Herangehensweise [2]. Die modifizierten Aminosäuren besitzen eine ähnliche chemische Struktur wie ihre natürlichen Analoga wodurch ihr Einfluss auf die Proteinfunktion klein gehalten wird. Gleichzeitig erlaubt ihre einzigartige Reaktivität die kontrollierte und ortsspezifische Funktionalisierung des Biomoleküls. Allerdings ist die für diese Methode notwendige Veränderung der Translationsmaschinerie sehr aufwendig und führt oft zu geringen Ausbeuten bei der Expression.

Chemoenzymatische Technologien bieten eine Alternative für die ortsspezifische Proteinfunktionalisierung [3]. Diese Systeme gehen oftmals mit hohen Expressionsausbeuten und einer guten Reaktionskontrolle einher. Allerdings wird deren Einsatz durch die Reversibilität einiger Kopplungen, Hydrolyse der Produkte und durch den negativen Einfluss auf die Proteinstruktur aufgrund großer, hydrophober Substrate beschränkt. Trotz großer Fortschritte in den letzten Jahren bleibt die ortsspezifische Proteinfunktionalisierung daher ein herausforderndes Forschungsgebiet.

Umprogrammierung eines natürlichen Enzymsystems

Tub-tag labeling, ein neuer Ansatz für die ortsspezifische Proteinmodifizierung [4], basiert auf einem natürlichen enzymatischen System, das die Funktion des intrazellulären Zytoskeletts  reguliert: Das Enzym TTL bindet dabei ein kurzes Erkennungsmotiv am C-Terminus des Proteins α-Tubulin und katalysiert den Anbau eines terminalen Tyrosinmoleküls. Diese Reaktion wurde umprogrammiert, indem die Erkennungssequenz des α-Tubulins, genannt Tub-tag, auf den C-Terminus beliebiger anderer Proteine übertragen wurde. Zusätzlich wurden statt Tyrosin unnatürliche Tyrosinderivate enzymatisch eingebaut. Diese synthetischen Aminosäuren tragen einzigartige reaktive Gruppen, welche für eine folgende, chemoselektive Reaktion wie eine Clickreaktion genutzt werden können (Abb. 1). Als Proof-of-principle wurden kürzlich Proteine wie GFP, Ubiquitin und rekombinante, einzelkettige Antikörper (Nanobodies) erfolgreich per Tub-tag labeling ortsspezifisch markiert. In diesen Experimenten wurde unter milden Reaktionsbedingungen und in kurzen Inkubationszeiten eine beeindruckende Reaktionseffizienz von bis zu 99 % erreicht. Außerdem erlaubt die Technologie abhängig vom eingebauten Tyrosinderivat ein breites Spektrum chemoselektiver Folgereaktionen wie Clickchemie (SPAAC), Staudingerligation, Hydrazon- und Oxim-bildende Reaktionen. Die Proteinfunktion wurde durch das Tub-tag labeling nicht beeinträchtigt, somit erfüllt die Technik auch diese besonders wichtige Schlüsselanforderung für die Markierung von Proteinen. Um dies zu belegen wurden Nanobodies mit Biotin oder Fluoreszenzfarbstoffen markiert und für spezifische Pulldown-Assays sowie Immunfärbereaktionen zellulärer  Strukturen verwendet.
Tub-tag labeling vereint die Vorteile verschiedener, zuvor etablierter Strategien zur ortsspezifischen Proteinmarkierung. Zum einen werden einfach zu synthetisierende, kleine unnatürliche Aminosäuren verwendet, sodass die biologische Funktion des markierten Proteins erhalten bleibt. Zum anderen wird ein hocheffizientes chemoenzymatisches System verwendet, das nahezu quantitative Umsätze erlaubt.

Konjugate aus Antikörpern und Wirkstoffen – ADCs

Mit diesen Eigenschaften – einfach, vielseitig, effizient – hat Tub-tag labeling besonderes Potential für die Erzeugung von Konjugaten aus Antikörpern und Wirkstoffen (Antibody Drug Conjugates, ADCs), einer neuen Klasse von Biopharmazeutika, welche zurzeit große Beachtung bei der Entwicklung neuer Krebstherapien finden. Seit der Zulassung der ersten beiden ADCs Adcetris and Kadcyla in den Jahren 2011 und 2013 hat sich das Forschungsgebiet  rasant entwickelt. In der Tat ist das Konzept stichhaltig, hochwirksame chemotherapeutische Wirkstoffe speziell zum Ort ihrer gewünschten Wirkung – dem Tumor – zu liefern und dadurch unerwünschte Nebenwirkungen, die klassischerweise mit chemotherapeutischen Maßnahmen einhergehen, zu minimieren (Abb. 2a).
In der Praxis ist die Herstellung von ADCs allerdings technisch herausfordernd und teuer und stellt die größte Hürde zur Entwicklung breiterer und wirksamerer Medikationsstrategien dar [5]. Die wertvollen Rohstoffe Antikörper und Wirkstoff müssen daher so effizient wie möglich miteinander verbunden werden. Bei der konventionellen ADC-Herstellung werden Aminosäuregruppen verwendet, die natürlicherweise im Antiköper vorhanden sind. Dies erlaubt aber nur eine geringe Kontrolle über den Konjugationsprozess, sodass oft heterogene Konjugate entstehen und möglicherweise die Funktion und Bindekapazität des Antikörpers verändert werden. Im Allgemeinen verursachen heterogene ADCs eine Verringerung der therapeutischen Aktivität. Daher ist es notwendig, ortsspezifische Konjugationsmethoden zu entwickeln, die eine bessere Kontrolle sowohl über das Verhältnis aus Antikörper und Wirkstoff (Drug-Antibody-Ratio, DAR) als auch über die Homogenität der erhaltenen Konjugate ermöglichen (Abb. 2b) [6].

Tub-tag-Perspektiven für die Entwicklung neuer ADCs

In den letzten Jahren wurden einige Methoden (und damit verbunden Start-Up Unternehmen) für die ortsspezifische Konjugation von Antikörpern mit Wirkstoffen etabliert. Dennoch stellt die Produktion homogen modifizierter ADCs auch heute noch eine große Herausforderung dar. Dies liegt vor allem an den hohen Anforderungen an die ADC-Produktion. Neben der Notwendigkeit, den Wirkstoff homogen und ortsspezifisch an den Antikörper zu konjugieren, muss die Technologie flexibel und effizient sein sowie stabile Produkte liefern. Außerdem sollte der Produktionsprozess einfach auf verschiedenste Konjugate übertragbar sein und darf keinerlei negativen Einfluss auf die Struktur oder Aktivität des Produkts haben. Die etablierten Methoden können diese Anforderungen nur teilweise erfüllen. Tub-tag labeling benötigt nur ein minimale, rekombinante Veränderung – die Einführung des Tub-tags – sodass seine Reaktionseffizienz sowie chemische Vielseitigkeit zu einer wirklichen Verbesserung im ADC-Feld führen könnte. Zurzeit laufen erste Experimente zur ADC-Produktion mithilfe von Tub-tag labeling in den Labors von Professor Christian Hackenberger und Professor Heinrich Leonhardt.

Literatur
[1] Dominik Schumacher, Christian PR Hackenberger: More than add-on: chemoselective reactions for the synthesis of functional peptides and proteins, Curr. Opin. Chem. Biol., 22, 62-69 (2014)
[2] Yane-Shih Wang, Xinqiang Fang, Ashley L. Wallace, Bo Wu, and Wenshe R. Liu: A Rationally Designed Pyrrolysyl-tRNA Synthetase Mutant with a Broad Substrate Spectrum, Am. Chem. Soc., 134, 2950-2953 (2012)
[3] Mohammad Rashidian, Jonathan K. Dozier, and Mark D. Distefano: Enzymatic Labeling of Proteins: Techniques and Approaches, Bioconjugate Chem., 24, 1277-1294 (2013)
[4] Dominik Schumacher, Jonas Helma, Florian A. Mann, Garwin Pichler, Francesco Natale, Eberhard Krause, M. Cristina Cardoso, Christian P. R. Hackenberger, Heinrich Leonhardt: Versatile and Efficient Site-Specific Protein Functionalization by Tubulin Tyrosine Ligase, Angew. Chem. Int. Ed., 54, 13787-13791 (2015)
[5]  Paresh Agarwal and Carolyn R. Bertozzi: Site-Specific Antibody–Drug Conjugates: The Nexus of Bioorthogonal Chemistry, Protein Engineering, and Drug Development, Bioconjugate Chem., 26, 176-192 (2015)
[6] Jun Y. Axup, Krishna M. Bajjuri, Melissa Ritland, Benjamin M. Hutchins, Chan Hyuk Kim, Stephanie A. Kazane, Rajkumar Halder, Jane S. Forsyth, Antonio F. Santidrian, Karin Stafin, Yingchun Lu, Hon Tran, Aaron J. Seller, Sandra L. Biroc, Aga Szydlik, Jason K. Pinkstaffe, Feng Tian, Subhash C. Sinha, Brunhilde Felding-Habermann, Vaughn V. Smider, and Peter G. Schultz: Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acidsProc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, 16101-16106 (2012)

Autoren
Dr. Jonas Helma 
(corresponding author)
LMU Biozentrum
Martinsried

M. Sc. Dominik Schuhmacher
Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie im Forschungsverbund Berlin e.V.
Berlin

Weitere Informationen zum Thema:
Mehr zum Thema Proteomik:
 http://www.git-labor.de/category/tags/proteomik
Interessanter Artikel zur Tub-tag Technologie: 
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201505456/pdf

 

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