Untersuchung von Nanopartikelaufnahmen in Modell-Zellen

Kombination analytischer Methoden

  • Abb. 1: Änderung des Brechungsindex im Inneren eines Vesikels bei NanopartikelaufnahmeAbb. 1: Änderung des Brechungsindex im Inneren eines Vesikels bei Nanopartikelaufnahme
  • Abb. 1: Änderung des Brechungsindex im Inneren eines Vesikels bei Nanopartikelaufnahme
  • Abb. 2: Streuverhalten der Nanopartikel (grün), der leeren Vesikel (rot) und der in Vesikel aufgenommenen Nanopartikel (blau)
  • Abb. 3: Abhängigkeit des Streuverhaltens in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an Nanopartikeln.
  • Abb. 4: Fluoreszenzintensität-Autokorrelationsfunktionen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe der markierten Nanopartikel zu einer wässrigen Lösung aus Vesikeln
  • Abb. 5: Cryo-TEM-Aufnahmen von Partikeln, die in Polymervesikel aufgenommen werden. Die Bildgesamtbreite entspricht 550 nm.
  • Abb. 6: Schematische Darstellung des Aufnahmeprozesses eines Partikels in ein Vesikel

Der transmembrane Transport von Molekülen und Partikeln aus der extrazellulären Umgebung in das Zellinnere ist von fundamentaler Bedeutung für die Funktionalität biologischer Systeme. Die Größe der transportierten Teilchen umspannt dabei mehrere Größenordnungen (von wenigen Ångstrom bis hin zu Mikrometern).

Kleine Ionen und Moleküle (< 10 Å) passieren die Membran über Ionenpumpen, Kanal- oder Carrier-Proteine. Größere Partikel (Durchmesser 10 – 100 nm) werden hingegen über andere Mechanismen transportiert, beispielsweise Endozytose. Die Mechanismen der Partikelaufnahme durch Endozytose sind jedoch sehr komplex und der Einfluss verschiedener Parameter noch nicht vollständig verstanden.

Die Wahl eines Modells
Theoretische Simulationen durch Deserno et al. [1,2] haben die physikalischen Aspekte dieses Prozesses untersucht und gezeigt, dass durch Adhäsion zwischen Membran und Partikeln und unter Berücksichtigung der mechanischen Eigenschaften der Membran eine Partikelaufnahme möglich ist, auch ohne die Anwesenheit von bioaktiven Komponenten.

Der komplexe strukturelle Aufbau von biologischen Membranen und die Kopplung von verschiedenen Wechselwirkungen machen die Interpretation von Daten, die aus direkten Untersuchungen an natürlichen Systemen gewonnen werden, sehr schwierig. Deshalb werden synthetische Membranen als Modellsystem herangezogen, mit deren Hilfe systematisch die Funktion einzelner Faktoren bestimmt und deren Interaktionen gezielt entkoppelt, gekoppelt und gesteuert werden können. Vielfältige Modellsysteme sind entwickelt worden. Um jedoch funktionelle Aspekte wie z. B. transmembrane Transportprozesse untersuchen zu können, sind derartige Modellsysteme nicht geeignet.

Ein neuartiges geeignetes minimales Modellsystem basiert auf frei diffundierenden Vesikeln, die spontan aus Poly(dimethylsiloxan)-Block- Poly(2-methyloxazolin) (PDMS-b-PMOXA), einem amphiphilen Diblock-Copolymer, in Wasser gebildet werden und mit Nanopartikeln wechselwirken, die der wässrigen Lösung nachfolgend zugesetzt werden [3]. Das verwendete Polymer mit einer Glasübergangstemperatur von Tg = -125 °C bietet die Möglichkeit, durch Extrusion Vesikel in der Größe von 200 nm herzustellen, die einen Elastizitätsmodul von 17 MPa und einen Biegemodul von 7 x 10-18 J aufweisen und somit über nanomechanische Eigenschaften verfügen, die denen von Zellmembranen ähneln [4].

Die Dimension der Vesikel liegt dabei weit unterhalb der Größe von Zellen. Dies bietet eine sehr geringe Polydispersität und somit eine bessere Kontrolle der Systemparameter wie z. B. Oberflächenkrümmung und Biegesteifigkeit sowie die Möglichkeit, detaillierte Untersuchungen anhand von Photonen- (PCS) und Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) durchführen zu können. Somit können Informationen zur Kinetik und Dynamik gewonnen werden, die an natürlichen Systemen nicht direkt zugänglich sind. Durch die Kombination von PCS und FCS sowie bildgebender Verfahren wie der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und der Rasterkraftmikroskopie (AFM) können umfangreiche Untersuchungen zur Größen-, Konzentrations- und Formabhängigkeit der Internalisierung von Nanopartikeln in Vesikel erfolgen.

PCS-Experiment
Werden Nanopartikel in ein Vesikel aufgenommen, so ändert sich der Brechungsindex n im Inneren des Vesikels. Dies lässt sich anschaulich in Abbildung 1 darstellen. In einer wässrigen Lösung von Vesikeln ergibt sich ein Brechungsindex im Inneren als auch außerhalb der Vesikel von n0 = n2 = nH2O = 1.333. Werden nun beispielsweise Polystyrol-Nanopartikel (PS) mit einem deutlich höheren Brechungsindex (nPS = 1.59) aufgenommen, so erhöht sich n2 [3]. Dies spiegelt sich in der absoluten Streuintensität Rvv(q) wieder, die deutlich ansteigt, wobei der Formfaktor P(q) erhalten bleibt. Hierzu wurden statische und dynamische Lichtstreuexperimente an den Einzelkomponenten sowie an den wechselwirkenden Lösungen der Komponenten durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Lichtstreuintensität in Anwesenheit von Nanopartikeln ist deutlich höher als die Streuintensität der Einzelkomponenten.

Als Vergleich wird die berechnete Streuintensität für eine wechselwirkungsfreie Koexistenz beider Spezies (offene Symbole) gezeigt. Weiterhin ist zu sehen, dass der Formfaktor frei diffundierender Vesikel gleich dem der Streuer im wechselwirkenden System ist. Durch eine Beschreibung der experimentellen Streudaten durch einen Formfaktorfit unter Berücksichtigung des oben beschriebenen Effekts ergibt sich eine Konzentrationsabhängigkeit, wie in Abbildung 3 gezeigt. Mit steigender Konzentration an Nanopartikeln steigt auch der Brechungsindex im Innern der Vesikel weiter an, was durch eine erhöhte Aufnahme von Nanopartikeln erklärt wird. Mithilfe der Fitmodelle kann berechnet werden, wie viele Nanopartikel im Durchschnitt pro Vesikel aufgenommen werden. Bei einer Erhöhung der Nanopartikelkonzentration von 0,1 g/l auf 0,2 g/l steigt die Anzahl aufgenommener Partikel von 7 auf 11 Teilchen an [5].

FCS-Experiment
In einem FCS-Experiment wird die Fluktuation der Fluoreszenzintensität aufgrund von Diffusionsprozessen in einem sehr kleinen Anregungsvolumen detektiert. Korrelationsanalysen dieser Fluktuationen liefern Informationen über das Diffusionsverhalten und die hydrodynamischen Größen der untersuchten Objekte. Werden in das oben beschriebenen Modellsystem Fluoreszenzfarbstoffe an die Nanopartikel gebunden, so kann über FCS eine zeitabhängige Änderung des Diffusionsverhaltens untersucht werden. Abbildung 4 zeigt typische Fluoreszenzintensität- Autokorrelationsfunktionen G(t), die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe der markierten Nanopartikel zu einer wässrigen Lösung aus Vesikeln aufgenommen wurden. Die Autokorrelationskurven verschieben sich deutlich mit steigender Expositionsdauer, wobei nach 2 h ein Gleichgewicht erreicht wird [3]. Dabei spiegelt FCS nur die Diffusion der fluoreszenzmarkierten Spezies wieder. Dies sind entweder frei bewegliche oder in die Vesikel aufgenommene Nanopartikel. Die Korrelationsfunktion nach 2 min zeigt deutlich, die Diffusion einzelner Nanopartikel mit einem hydrodynamischen Radius Rh entsprechend der Partikelgröße.

In einem späten Stadium nach 2 h ergibt sich ein Rh von 95 nm, was der Größe der Vesikel entspricht. Da die Nanopartikel über diesen Zeitraum stabil sind und nicht aggregieren (Nachweis über PCS), kann aus den Ergebnissen abgeleitet werden, dass eine Nanopartikelaufnahme durch die Vesikel stattfindet. Eine Anlagerung der Nanopartikel an die äußere Oberfläche der Vesikel kann ausgeschlossen werden, da dies mit einer Größen- und Formfaktoränderung verbunden wäre. Beides ist nicht der Fall, wie durch PCS Experimente gezeigt wurde. Weiterhin konnte aus der Änderung der Fluoreszenzstärke berechnet werden, dass nach 2h der Aufnahmeprozess unter den gegebenen Bedingungen abgeschlossen ist und im Durchschnitt ca. 16 Nanopartikel pro Vesikel aufgenommen wurden [3]. Dies zeigt eine gute Übereinstimmung zu den in PCS bestimmten Daten, wie oben dargestellt.

TEM-Experiment
Zur Visualisierung des Aufnahmeprozesses wurden Cryo-TEM Untersuchungen durchgeführt. Cryo-TEM Aufnahmen liefern eine statische Abbildung des Systems zu einem bestimmten Zeitpunkt. Da der Aufnahmeprozess auf relativ kurzen Zeitskalen abläuft, konnte mit Cryo-TEM keine Abbildung zu unterschiedlichen Zeitpunkten / Stadien erfolgen. Über die Kinetik des Prozesses geben jedoch wie zuvor dargestellt FCS- und PCS-Untersuchungen Aufschluss. Wie in Abbildung 5 zu sehen, werden Nanopartikel durch einen Einstülpungsvorgang aufgrund einer Deformation der Membran von den Vesikeln einverleibt. Durch eine Auswertung einer Vielzahl von Cryo-TEM Aufnahmen konnte schließlich ein Mechanismus der Nanopartikelaufnahme abgeleitet werden.

Dieser Prozess kann in 4 Schritten beschrieben werden und ist schematisch in Abbildung 6 dargestellt. In einem ersten Schritt findet eine Adsorption der Partikel auf der Vesikeloberfläche statt, gefolgt von einer Deformation der Membran, die zu einer Einstülpung führt. Durch diese Einstülpung entstehen „Taschen“, in denen die Nanopartikel eingebunden sind. Nach und nach wird nun die gesamte Partikeloberfläche durch die Vesikelmembran bedeckt. Am Ende dieses Prozesses wird der von der Membran vollständig umschlossene Partikel in das Innere des Vesikels abgeschnürt.

Transmembraner Transport von Nanopartikeln kann also von fluiden synthetischen Membransystemen mit angemessenen physikalischen Parametern imitiert werden. Dieser Prozess ähnelt sehr der aus der Natur bekannten Endozytose, ist jedoch vollkommen unabhängig von bioaktiven Komponenten. Der Prozess selbst ist getrieben durch physikalische Parameter. So sind beispielsweise Adhäsionskräfte ausschlaggebend für die Anbindung der Nanopartikel an die Vesikeloberfläche. Zu schwache attraktive Wechselwirkungen haben keine Aufnahme zur Folge. Weiterhin ist die Deformierbarkeit der Vesikelmembran entscheidend für einen vollständigen Aufnahmeprozess. Membranen mit einem zu niedrigen Elastizitätsmodul können die erforderliche Verformung nicht aufweisen und die absorbierten Partikel bleiben an der äußeren Vesikeloberfläche gebunden.

Fazit
Durch eine Kombination unterschiedlichster analytischer und bildgebender Methoden können solch komplexe Prozesse wie die Nanopartikelaufnahme untersucht werden. Dabei liefert nicht eine einzige Methode die relevanten Ergebnisse. Erst durch eine Interpretation der aus verschiedenen Techniken gewonnenen Daten kann ein Gesamtbild abgeleitet werden. Dies eröffnet vielfältige Möglichkeiten zur Untersuchung von nanopartikulären Systemen, wobei die Ergebnisse zu einem umfassenderen Verständnis beitragen können.

Literatur
[1] Deserno M.: et al.: Europhysics Letters 62, 767 (2007)
[2] Reynwar B. J. et al.: Nature 447, 461-464 (2007)
[3] Jaskiewicz K. et al.: Angewandte Chemie 124, 4691-4695 (2012)
[4] Jaskiewicz K. et al.: Langmuir 28, 12629 – 12636 (2012)
[5] Jaskiewicz K. et al.: ACS Nano 6, 7254-7262 (2012)

 

Autor(en)

Kontaktieren

Max-Planck-Institut für Polymerforschung
Ackermannweg 10
55128 Mainz
Telefon: +49 6131 379 0
Telefax: +49 6131 379 100

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.