Vermehrung von Mikroorganismen

Geschwindigkeit geht vor und zu Lasten von Effizienz

  • Abb. 1: Mutmaßliches Schicksal von Glucose bei Acetobacter methanolicus. qS [g Glucose/g TS · h], µ [h–1], CS Citratsynthase, GDH Glucose-Dehydrogenase [µmol/mg TS · h], PGA 3-Phosphoglycerat; E „biologische“ Energie, ETCC >> EGDH  Abb. 1: Mutmaßliches Schicksal von Glucose bei Acetobacter methanolicus. qS [g Glucose/g TS · h], µ [h–1], CS Citratsynthase, GDH Glucose-Dehydrogenase [µmol/mg TS · h], PGA 3-Phosphoglycerat; E „biologische“ Energie, ETCC >> EGDH
  • Abb. 1: Mutmaßliches Schicksal von Glucose bei Acetobacter methanolicus. qS [g Glucose/g TS · h], µ [h–1], CS Citratsynthase, GDH Glucose-Dehydrogenase [µmol/mg TS · h], PGA 3-Phosphoglycerat; E „biologische“ Energie, ETCC >> EGDH
  • Prof. Dr. Wolfgang Babel, Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung

Befinden sich vermehrungsbereite Mikroorganismen in einem ihnen vertrauten Medium, in dem nichts fehlt oder zu viel ist, und entsprechen die abiotischen Bedingungen - darunter Temperatur, pH-Wert, Wasseraktivität - dem Genotyp, dann vermehren sich Bakterien exponentiell, mit konstanter Geschwindigkeit und effizient. Aber mit welcher Geschwindigkeit und Effizienz können sie sich vermehren, stellt sich die Frage. Und welche Bedeutung haben diese Parameter ökologisch bzw. (über)lebensstrategisch?

Effizienz der Vermehrung


Die Ertragskoeffizienten (YX/S in g/g, CCE in%) sind erfahrungsgemäß substratabhängig, z.B CCEGlucose > CCEPhenol. Warum das so ist, welche Faktoren welche Rolle spielen, kann solide erklärt und verlässlich berechnet werden [1]. Die Ertragskoeffizienten sind keine Konstanten; die grundsätzlich möglichen werden praktisch kaum erreicht. Das liegt daran, dass die Bedingungen nicht optimal sind und ggf. auch Stress-Situationen bewältigt werden müssen, Unausgewogenheit dominiert. Sofern Kohlenstoff und Energie hinreichend zur Verfügung stehen, bleibt die Chance bestehen, sich zu erhalten. Die Organismen können sich sogar vermehren. Ist die Aufnahme der „Elemente" nicht streng kontrolliert, kommt es auch zell-intern zu Imbalancen. Bestimmte Intermediate haben nicht mehr den für die Vermehrung notwendigen „Partner" bzw. stoßen auf organismus-/stamm-typische Flaschenhälse. Sie werden „überflüssig", „fließen" aus (über) oder werden intrazellulär deponiert. Oder das Substrat wird gar nicht erst aufgenommen, sondern schon quasi extrazellulär modifiziert, transformiert bzw. unvollständig oxidiert. Welche Produkte entstehen, ist abhängig von den genetisch bedingten Möglichkeiten, vom physiologischen Zustand, von der Limitation sowie vom Substrat. Beispiele für overflow metabolites sind u.a. Ethanol, Citronensäure, Poly-ß-Hydroxybuttersäure (PHB), Gluconsäure.

Effizienz der Vermehrung unter suboptimalen Bedingungen

Sehen sich zur alkoholischen Gärung befähigte Mikroorganismen einem dem Genotyp nicht gerechten Glucose/Sauerstoff-Verhältnis (Sauerstoff-Defizit) gegenüber, dann bilden sie statt des dissimilatorischen Kohlendioxids Ethanol.

Da simultan ATP bereit gestellt wird, sollten sich diese Organismen auch weiterhin vermehren können. Unter aeroben Bedingungen vermögen sich Bakterien und Hefen mit einem YX/S von ca. 0,5 g Trockensubstanz/g Glucose zu vermehren. Wenn sie auf Gärung umschalten, stehen nur 2 ATP/Glucose zur Verfügung. Würde diese Energie für die Zellvermehrung gebraucht werden, ergäbe sich theoretisch ein YX/S von ca. 0,12g/g, berechnet auf der Basis des Konzeptes von einem zentralen Präkursor (PGA) und einem YATP-Wert von 10,5 g Trockensubstanz pro Mol ATP. (Dieser bzw. ein so ähnlicher Wert wird tatsächlich auch praktisch gefunden.)

Bei der Überproduktion von Citronensäure wird ebenfalls biologische Energie freigesetzt: 1 Glucose → 1 CiA + 1 ATP + 3 NAD(P)H. Würde nur diese Energie für die Zellvermehrung genutzt werden, und die Bedingungen ließen Vermehrung auch weiterhin zu, dann könnten statt der ca. 0,5 g Trockensubstanz/g Glucose nur ca. 0,3 g/g gebildet werden. Fehlt Organismen, die zur PHB-Bildung fähig sind, zum Beispiel eine geeignete Stickstoff-Quelle, so dass NAD(P)H überflüssig wird, da es nicht mehr in reduktiven Aminosäure-Synthesen verbraucht werden kann, dann akkumulieren sie intrazellulär PHB. Wie im Falle der alkoholischen Gärung ist auch bei der PHB-Bildung - sofern Stickstoff nicht völlig fehlt - Vermehrung möglich, da parallel zur PHB-Bildung biologische Energie freigesetzt wird: 1 Glucose → 1 PHB + 2 CO2 + 2 ATP + 3 NAD(P)H. Würde diese Energie für die Vermehrung genutzt, könnte theoretisch pro g Glucose mehr Biomasse gebildet werden, nämlich ca. 0,58 g/g, wenn die gebildete PHB (ca. 45,5% der Zelltrockensubstanz) als zur Zellsubstanz gehörend angesehen wird. Wird die gebildete PHB substrahiert, der Ertragskoeffizient also für PHB-freie Biomasse berechnet, dann ist dieser selbstverständlich niedriger, nämlich lediglich ca. 0,32 g/g.

Geschwindigkeit der Vermehrung

Die Effizienz der Vermehrung ist bioenergetisch limitiert [1]. Weshalb auch die Vermehrungsgeschwindigkeit vom Substrat und von den Assimilations-Wegen (z.B. Phenol: Oxoadipat- oder Oxosäure-Weg) abhängig ist, kann nicht so eindeutig gesagt werden, ebenso nicht, wodurch µmax determiniert wird. Anders als bei der Effizienz kommen mehrere Möglichkeiten in Betracht.

Wenn richtig ist, dass bei zur alkoholischen Gärung befähigten Organismen die spezifische Ethanolbildungsrate kEthanol die Vermehrungsgeschwindigkeit bestimmt, dann wird µanaerob von der ATP-Generierungsrate kATP (Mol ATP/g Trockensubstanz · h) determiniert. Danach sollten sich gärende Zellen, die Ethanol mit einer kEthanol von z.B. 1,7 g/g · h bilden, mit einer Geschwindigkeit wie unter aeroben Bedingungen (ca. 0,5 h-1) vermehren können,vorausgesetzt vermehrungsrelevante (Synthese-)Prozesse sind nicht gedrosselt und die spezifische Aufnahmerate qS (g Substrat/g Trockensubstanz · h) ist hinreichend groß. Wenn die Zellen Ethanol mit z.B. YP/S = 0,42 g Ethanol/g Glucose bilden, müsste qGlucose ca. 4,1 g/g . h sein. Unter aeroben Bedingungen, wenn sich die Organismen z.B. mit YX/S = 0,5 g/g und µaerob = 0,5 h-1 vermehren würden, reicht 1 g/g · h. Das heißt, µaerob dürfte nicht von qS bestimmt werden.

Acetobacter methanolicus MB58 (Acidomonas methanolica) ist ein fakultativ methylotrophes Bakterium, das auch Glucose nutzen kann [2, 3]. Wenn es chemostatisch vermehrt wird, bildet es bis zu einer bestimmten Verdünnungsrate schlanke Biomasse, Kohlendioxid, Wasser und Wärme. Bei D = 0,1 h-1 ist YX/S = 0,31 g/g. NAD(P)H und ATP, die für die Erhaltung sowie Vermehrung erforderlich sind, werden - wie für aerobe Chemoorganoheterotrophe üblich - sehr wahrscheinlich via Tricarbonsäure-Zyklus + ETP generiert (s. Abb. 1).

Wird die Geschwindigkeit über ca. 0,16 h-1 hinaus erhöht, beginnen die Zellen Gluconsäure zu bilden und PQQ-vermittelt ATP zu generieren. Mit jeder weiteren Erhöhung von D nimmt YX/S ab. Die Zellen „schaffen" (d.h. D = µ ) auch noch 0,25 h-1, allerdings ist bei diesem D der Ertragskoeffizient nur noch 0,09 g/g. Was auffällt: Die Geschwindigkeit geht zu Lasten der Effizienz.

Prinzipiell ähnlich verhält sich Ralstonia eutropha JMP134 bei chemostatischer Vermehrung auf Phenol. Bis zu einem D von ca. 0,28 h-1, benutzt es den ortho-Weg (CCE 46%). Danach wird der weniger effiziente meta-Weg (CCE 40%), der raschere Vermehrung ermöglicht, induziert. Interessant, dass die Geschwindigkeit auch durch Zufüttern von Formiat, das NADH (bzw. ATP) liefert, erhöht werden kann. Da mit Hilfe von Formiat die CCEPhenol steigt, könnte vermutet werden, die Geschwindigkeit korreliert mit dem Energie-Reichtum der(s) Substrate(s), d.h mit der Verbrennungsenthalpie, mit den available electrons oder der gewinnbaren biologischen Energie [1]. Allerdings, dass sich Mikroorganismen auf Mischungen aus zwei bioenergetisch defizitären Substraten, z.B. Phenol + Glucose (Pseudomonas putida P3) oder Methanol + Glucose oder + Xylose (Hansenula polymorpha), schneller vermehren können als auf nur einem Substrat [1], unterstützt diesen Verdacht nicht. Auch spricht das „Umschalten" vom ortho- auf den meta-Weg dagegen.

Fazit

Leben ist zielstrebig. Es ist auf Erhaltung programmiert. Individuen erhalten sich durch Infragestellen und Erneuern aller Strukturen und Funktionen, Arten bzw. Populationen durch Wachstum und Vermehrung. Dafür benötigen sie Energie und eine Vielzahl von Elementen, einige davon in Form von Verbindungen, z.B. C als CO2 und/oder CxHyOz und P als PO43-.

Gleichgültig wie Mikroorganismen leben, ob in Mono- oder Mischkulturen, jedes Individuum befindet sich in Konkurrenz mit jedem anderen. Insofern sind, wenn vom Aufwand für die Erhaltung und von der Affinität abgesehen werden, Effizienz und Geschwindigkeit zwei wichtige Parameter. Dass Mikroorganismen in natürlichen Ökosystemen, die in der Regel nicht balanciert komponiert sind, die angebotenen Substrate nicht so effizient wie gemäß Ausstattung möglich für ihre Vermehrung verwerten können, ist trivial. Sofern unter Bedingungen von overflow metabolism Vermehrung stattfindet, überrascht es jedoch, dass sie sich mit Geschwindigkeiten vermehren können, die gar nicht kleiner zu sein brauchen als im balncierten Zustand. Wahrscheinlich weil der Weg zur Generierung biologischer Energie kürzer wird. Entscheidend für die Geschwindigkeit der Vermehrung ist wohl nicht das Energie-Angebot oder maximaler Energiegewinn, sondern die Geschwindigkeit, mit der biologischen Energie generiert werden kann [1, 4, 5]. Sofern die Substrat-Konzentration so groß ist, dass nicht die Affinität zum kritischen Parameter wird, bleiben die Organismen konkurrenzfähig. In solchen Konkurrenzsituationen gilt anscheinend: Geschwindigkeit geht vor Effizienz.

Referenzen
[1] Babel W. et al.: Acta Biotechnol. 13, 211-242 (1993)
[2] Uhlig H. et al.: Int. J. Syst. Bacteriol. 36, 317-322 (1986)
[3] UFZ/Vogelbusch-Prospekt we make biotechnology work: gluconic acid technology
[4] Babel,W.: BIOspektrum 15, 730 - 733 (2009)
[5] Costa E. et al.: Trends in Microbiol. 14, 213- 19 (2006)

Danksagung
Frau Dagmar Fiedler hat die Abbildung gezeichnet. Dafür sei ihr herzlich gedankt.

Autor(en)

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