Von schaltbaren Farbstoffen zu scharfen Bildern

Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie in Bakterien

  • Abb. 1: Prinzip der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie mittels Einzelmoleküldetektion. Photoschaltbare Fluoreszenzfarbstoffe und fluoreszierende Proteine können durch Bestrahlung mit Licht definierter Wellenlänge ein- und ausgeschaltet werden (A). Auf diese Weise kann das Fluoreszenzsignal einer dicht markierten Probe zeitlich aufgetrennt die Signale einzelner Farbstoffe sichtbar gemacht werden (B). In einem nächsten Schritt wird die räumliche Position der Fluoreszenzfarbstoffe anhand des Emissionsmaximums mathematisch auf wenige Nanometer genau bestimmt. Durch die Aufnahme und Auswertung von großen Bilderserien (typischerweise 5.000 – 20.000 Einzelbilder) wird die Position von sehr vielen Farbstoffen bestimmt, und aus deren Koordinaten ein künstliches Bild rekonstruiert. Mit diesem Verfahren können zelluläre Strukturen mit einer Auflösung von ca. 20 nm dargestellt werden. Maßstabsbalken 1 µm.Abb. 1: Prinzip der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie mittels Einzelmoleküldetektion. Photoschaltbare Fluoreszenzfarbstoffe und fluoreszierende Proteine können durch Bestrahlung mit Licht definierter Wellenlänge ein- und ausgeschaltet werden (A). Auf diese Weise kann das Fluoreszenzsignal einer dicht markierten Probe zeitlich aufgetrennt die Signale einzelner Farbstoffe sichtbar gemacht werden (B). In einem nächsten Schritt wird die räumliche Position der Fluoreszenzfarbstoffe anhand des Emissionsmaximums mathematisch auf wenige Nanometer genau bestimmt. Durch die Aufnahme und Auswertung von großen Bilderserien (typischerweise 5.000 – 20.000 Einzelbilder) wird die Position von sehr vielen Farbstoffen bestimmt, und aus deren Koordinaten ein künstliches Bild rekonstruiert. Mit diesem Verfahren können zelluläre Strukturen mit einer Auflösung von ca. 20 nm dargestellt werden. Maßstabsbalken 1 µm.
  • Abb. 1: Prinzip der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie mittels Einzelmoleküldetektion. Photoschaltbare Fluoreszenzfarbstoffe und fluoreszierende Proteine können durch Bestrahlung mit Licht definierter Wellenlänge ein- und ausgeschaltet werden (A). Auf diese Weise kann das Fluoreszenzsignal einer dicht markierten Probe zeitlich aufgetrennt die Signale einzelner Farbstoffe sichtbar gemacht werden (B). In einem nächsten Schritt wird die räumliche Position der Fluoreszenzfarbstoffe anhand des Emissionsmaximums mathematisch auf wenige Nanometer genau bestimmt. Durch die Aufnahme und Auswertung von großen Bilderserien (typischerweise 5.000 – 20.000 Einzelbilder) wird die Position von sehr vielen Farbstoffen bestimmt, und aus deren Koordinaten ein künstliches Bild rekonstruiert. Mit diesem Verfahren können zelluläre Strukturen mit einer Auflösung von ca. 20 nm dargestellt werden. Maßstabsbalken 1 µm.
  • Abb. 2: Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung verschiedener Molekülklassen in Bakterien. Dynamisch bindende Membran-Marker erlauben es, die Stäbchenform des gramnegativen Bakteriums Escherichia Coli exakt darzustellen (A). Gleichzeitig kann die Anzahl und Verteilung eines Fusionsproteins (hier RNA-Polymerase mit photoaktivierbarem mCherry1) durch PALM bestimmt werden (B). dSTORM Messungen zeigen zudem, dass dessen Interaktionspartner DNS unter guten Wachstumsbedingungen eine stark strukturierte Organisation aufweist (C). Anders als beim Durchlichtbild des Bakteriums (D) kann so die Position des Chromosoms im Zellzylinder visualisiert (E) oder die räumliche Verteilung von DNS und RNA-Polymerase untersucht werden (F). Mittels konventioneller konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie (G-I) sind diese Details nicht zu erkennen. Maßstabsbalken 1 µm.

Neue Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen die Auflösung kleinster zellulärer Strukturen. Hierbei kommen photoschaltbare Fluoreszenzfarbstoffe zum Einsatz, welche eine zeitlich getrennte Ortsbestimmung ermöglichen, sodass die Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie umgangen werden kann. Diese Verfahren der hochauflösenden Mikroskopie ermöglichen die Untersuchung intrazellulärer Strukturen in Bakterien.

Die Fluoreszenzmikroskopie ist in vielen Bereichen der alltäglichen Forschung allgegenwärtig. Gerade die zellbiologische Forschung wurde in den vergangenen Jahrzehnten hierdurch revolutioniert: zelluläre Strukturen können mit hohem Kontrast sichtbar gemacht werden und Prozesse, wie beispielsweise die Infektion mit einem Virus, kann in lebenden Zellen verfolgt werden. Der hohe Kontrast der Fluoreszenzmikroskopie sowie die Entwicklung immer sensitiverer Detektoren erlauben heute die Visualisierung einzelner Fluoreszenzfarbstoffmoleküle: hierdurch wurde das Forschungsgebiet der Einzelmolekülmikroskopie und –spektroskopie begründet.

Hochauflösende Verfahren
Wie jedes lichtbasierte Mikroskopieverfahren unterliegt auch die Fluoreszenzmikroskopie einer fundamentalen Grenze, der „Beugungsgrenze“. Erstmals von Ernst Abbe 1873 für die Durchlichtmikroskopie formuliert, lässt sich diese in einfachen Worten wie folgt übersetzen: Objekte oder Strukturen, welche einen Abstand von weniger als der halben Wellenlänge des emittierten Fluorszenzlichtes haben (d.h. in etwa 200 bis 300 nm), können optisch nicht voneinander getrennt oder aufgelöst werden. So können kleine biologische Systeme wie Viren oder Bakterien zwar mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert werden; die innere Struktur jedoch blieb der optischen Mikroskopie verborgen, und war lange Zeit nur mit Elektronenmikroskopie zugänglich. Neue Verfahren der Fluorszenzmikroskopie können diese Auflösungsgrenze umgehen. Hierzu zählen deterministische Methoden wie „stimulated emission depletion“ (STED) [1] oder „(saturated) structured illumination microscopy“ ((S)SIM) [2,3], sowie Einzelmolekülverfahren wie „photoactivated localization microscopy“ (PALM) [4] und „(direct) stochastic optical reconstruction microscopy“ ((d)STORM) [5,6].

Für die Entwicklung von mikroskopischen Verfahren zur hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie wurden W.E. Moerner (Stanford), Eric Betzig (Janelia Farm) und Stefan Hell (Göttingen) mit dem diesjährigen Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.
Die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie mittels Einzelmoleküldetektion ((d)STORM, PALM) nutzt photochemische oder photophysikalische Eigenschaften von Fluoreszenzfarbstoffen aus, um diese gezielt ein- und auszuschalten (Abb. 1A). Grundlage dieser Prozesse können lichtinduzierte chemische Reaktionen sein, wie beispielsweise die Veränderung der elektronischen Struktur oder der Bruch der Bindung in einem Fluoreszenzfarbstoff durch Licht, sowie die Erzeugung von nicht-fluoreszierenden Zwischenprodukten [7]. Auf diese Weise ist es möglich, die Anzahl der aktiven fluoreszierenden Moleküle in einer Probe zu kontrollieren. In der Praxis des Mikroskopieexperiments geschieht dies mit zwei Anregungswellenlängen: die Bestrahlung mit Licht einer ersten Wellenlänge aktiviert Fluorophore, sodass deren Signal ausgelesen werden kann; die Bestrahlung mit Licht einer zweiten Wellenlänge liest das Fluoreszenzsignal aus, und führt gleichzeitig zur Photozerstörung und somit zum permanenten Auslöschen des Farbstoffes. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt in der zeitlichen Trennung des Fluoreszenzsignals einer farbstoffmarkierten Probe: anstatt alle Farbstoffe auf einmal aufzunehmen und der Beugungsgrenze zu unterliegen, können nun Farbstoffmoleküle einzeln detektiert werden, und ihre Position sehr genau bestimmt werden (Abb. 1B). Dies gelingt umso besser, je mehr Photonen von einem Farbstoffmolekül detektiert werden, und kann bis auf wenige Nanometer genau geschehen. Beendet ist das Experiment dann, wenn die Position aller Fluoreszenzfarbstoffe ausgelesen wurde. Als Ergebnis wird eine Aufstellung der Koordinaten aller Farbstoffmoleküle erhalten, welche, als einzelne Punkte dargestellt, ein künstliches Bild ergeben (Abb. 1). Dieses Bild kann eine räumliche Auflösung von 20 nm oder besser erreichen, und ist damit pro Raumdimension in etwa um eine Größenordnung besser aufgelöst als die Beugungsgrenze zulässt.
Für welche Fragestellungen sind diese Verfahren nun geeignet? Eine höhere räumliche Auflösung erlaubt zunächst einen „schärferen“ Blick auf eine zelluläre Struktur. So können Strukturen sichtbar gemacht werden, die bisher durch die Beugungsgrenze in der Lichtmikroskopie verborgen blieben – beispielsweise die Geometrie eines zellulären Komplexes wie der Kernpore [8], welche einen Durchmesser von gerade einmal 120 nm besitzt. Zudem kann die räumliche Organisation von Biomolekülen zueinander visualisiert werden, und hieraus neue Information über den Ablauf zellulärer Prozesse gewonnen werden. Schließlich können kleinste Strukturen nicht nur aufgelöst werden, sondern sogar quantifiziert werden: die Detektion einzelner Moleküle ermöglicht in einem geeigneten Experiment das Zählen von Proteinen, und somit die Bestimmung der Zusammensetzung molekularer Maschinen [9].

Bakterien unter der Fluoreszenz-Lupe
Besonders interessant ist die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie für die Untersuchung von kleinen biologischen Systemen wie Bakterien. Hier haben lichtmikroskopische Verfahren in der Vergangenheit nur sehr begrenzt zur Beobachtung zellulärer Prozesse beitragen können (Abb. 2). Das gramnegative Darm-Bakterium Escherichia coli hat beispielsweise eine Länge von etwa 3–5 µm, und einen Durchmesser von etwa 1 µm. In diesem kleinen Raum sind sämtliche zellulären Prozesse untergebracht, welche die Homöostase und die Vermehrung der Zelle, aber auch deren Reaktion auf die Umwelt ermöglichen. Anders als bei den viel größeren Säugerzellen sind in E. coli keine Kompartimente bekannt, jedoch ist sicher von einer gewissen Ordnung auch in diesem Organismus auszugehen. Mittels hochauflösender Mikroskopie konnten molekulare Maschinen in E. coli visualisiert und deren Organisation quantifiziert werden. Hierzu zählt das Chemotaxis-Netzwerk [10], als auch „Hot-Spots“ der Transkription [9]. Darüber hinaus weist E. coli eine besondere strukturelle Organisation des Chromosoms auf, welche sich je nach Wachstumsbedingung und Umgebungsstimulus anpassen und teilweise dramatisch ändern kann. Die beugungsbegrenzte Mikroskopie kommt bei Strukturen wie dem Chromosom von E. coli (ca. 0.5 x 0.5 µm²) klar an ihre Grenzen. Mittels hochauflösender Mikroskopie konnte jedoch sowohl die Feinstruktur des Chromosoms visualisiert werden als auch dessen Änderung während des Zellzyklus sowie dessen Abhängigkeit von Wachstumsbedingungen und äußerer Stimuli [11] (Abb. 2). Die Kombination verschiedener Färbemethoden ermöglicht es weiterhin, unterschiedliche Molekülklassen in ein und derselben Zelle hochaugelöst zu detektieren. Hierdurch kann beispielsweise die genaue Positionierung des Chromosoms innerhalb des Zellzylinders (Abb. 2E) sowie die räumliche Interaktion von Proteinen und DNA (Abb. 2F) visualisiert werden.

Zusammenfassung
Die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie stellt noch ein relativ junges Forschungsgebiet dar, entsprechende Techniken sind erst seit wenigen Jahren in den Laboren der angewandten Forschung vertreten. Durch das Engagement verschiedener Mikroskop-Hersteller sind jedoch seit einigen Jahren kommerzielle Systeme erhältlich: diese Geräte können einerseits auch von nicht-Spezialisten betrieben werden, andererseits ist ein hohes Potential der zugrundeliegenden Techniken bereits abrufbar.

Die Referenzen sind bei den Autoren erhältlich.

Kontakt 
Mike Heilemann, Christoph Spahn
Institut für Physikalische and Theoretische Chemie
Goethe-Universität Frankfurt
heilemann@chemie.uni-frankfurt.de
www.smb.uni-frankfurt.de

Ulrike Endesfelder
Department of Systems and Synthetic Microbiology
Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie
Marburg
www.mpi-marburg.mpg.de/endesfelder

Weitere Beiträge zum Thema:
http://www.git-labor.de/category/tags/fluoreszenzmikroskopie

Chemgapedia-Lerneinheit zum Thema:
http://www.chemgapedia.de/vsengine/glossary/de/immunfluoreszenzmikroskopie.glos.html

 

 

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