Wenn Reproduzierbarkeit gefragt ist

Analyse von Metaboliten mittels automatisierter Bligh-Dyer-Extraktion und online LC-MS

  • Abb. 1: Arbeitsablauf der automatisierten Bligh-Dyer-Extraktion.
  • Abb. 2: LC-MS Massenspuren (XIC) ausgewählter Metaboliten.
  • Tab. 1: Berechnete logP, logD und pKa-Werte für die untersuchten Standards (berechnet mit ACD/Labs Percepta, Version 2012).
  • Abb. 3: Retentionszeiten ausgewählter Verbindungen A) nur mobile Phase pH 8.3, B) Wechsel mobile Phase pH 3 und 8.3 nach jeder Injektion, C) Wechsel mobile Phase pH 3 und 8.3 nach jeder zweiten Injektion.

 

Die Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) ist ein effizientes Verfahren zur gleichzeitigen Extraktion von hydrophoben und polaren Metaboliten und wird daher in der Metabolomforschung häufig eingesetzt. Das Verfahren nutzt unterschiedliche Verteilungskoeffizienten verschiedener Verbindungsklassen, um Metaboliten anzureichern und von unerwünschten Verbindungen zu trennen. Diese zeitaufwendige Probenvorbereitung wird meistens manuell durchgeführt. Dieser Artikel beschreibt die vollautomatisierte Bligh-Dyer-Extraktion [1-3] mit gekoppelter UHPLC-MS/MS-Trennung für die metabolische Analyse von Geweben und Zellen.
 
Bligh-Dyer-Methode
Die Bligh-Dyer-Extraktion [3] ist eine dreistufige Flüssig-Flüssig-Extraktion, die üblicherweise manuell durchgeführt wird. Sie umfasst folgende Schritte: 1) Behandlung der Probe mit Methanol und Chloroform, 2) nur Chloroform und dann 3) unter Zusatz von Wasser. Diese Schritte stellen sicher, dass nicht-lipidische Verunreinigungen, die auch extrahiert wurden, abgetrennt werden. Um die Autoxidation ungesättigter Fettsäuren und die Hydrolyse von Lipiden zu minimieren, müssen spezielle Vorkehrungen getroffen werden.
 
Instrumentierung und Software
Die gesamte Probenvorbereitung sowie die LC-Injektionen wurde mit einem PAL RTC-Roboter (CTC Analytics, Zwingen, Schweiz) durchgeführt. Für die LC-Trennung der Bligh-Dyer-Fraktionen wurden zwei quaternäre Niederdruckpumpen Nexera LC30AD UHPLC (Shimadzu, Tokio, Japan) eingesetzt. Der RCT-Roboter injizierte die resultierenden wässrigen Fraktionen auf eine 100 x 2,1 mm XBridge BEH 3.5 μm C18 XP-Säule (Waters, Milford, MA, USA), die abwechselnd mit einer sauren oder einer basischen mobilen Phase betrieben wurde. Die organischen (CHCl3) Fraktionen wurden auf eine 150 x 2,1 mm XBridge BEH C8 XP Säule injiziert. Beide Säulen wurden bei 40 °C gehalten. Die UHPLC-Plattform mit 2 Säulen war an ein TripleTOF 5600 MS (Sciex, Concord, Kanada) gekoppelt. Daten wurden im Positivmodus mit einer Turbo-V-Ionenquelle erfasst, die mit einer APCI-Sonde zur automatischen Kalibrierung ausgestattet war.

Der RCT-Roboter wurde durch PAL Sample Control gesteuert.

 
Probenvorbereitung
Abbildung 1 zeigt den Probenvorbereitungsablauf für die automatisierte Bligh-Dyer-Extraktion. Zuerst wurden den Rohproben (Zellsuspension) 1 mL kaltes (-20° C) Methanol zugegeben. Nach Zentrifugation bei 3000g wurden die Proben mit flüssigem Stickstoff eingefroren und dann in einem Blender gemahlen. Der RTC-Roboter führte anschliessend alle notwendigen Extraktionsschritte durch, fraktionierte die Extraktionsschichten (organisch/wässrig) und fügte interne Standards zu. Zuerst wurden 225 μL H2O + 225 μL CHCl3 zu den Proben hinzugefügt, die dann 5 Minuten bei 3000g zentrifugiert wurden. 500 μL der oberen Fraktion wurden dann 5-fach verdünnt, indem 60 μL bis 240 μL Verdünnungslösungsmittel (10 % MeOH in Proben) zugegeben wurden. Anschließend wurden chromatographische Standards hinzugefügt und 25 μL auf die C18-Säule injiziert (UHPLC-System 1). 250 μL der untersten Fraktion (CHCl3) wurden mit Stickstoff (0,35 bar, 35° C für 10 Minuten) bis zur Trockenheit eingedampft. Die Probe wurde dann in 150 μL MeOH rekonstituiert, chromatographische Standards wurden hinzugefügt und 5 μL auf die C8-Säule injiziert (UHPLC-System 2).
Die automatisierte Methode erwies sich als wesentlich effizienter und reduzierte die gesamte Probenvorbereitungszeit von ca. 3 Stunden für die Vorbereitung eines Dutzend Proben auf ca. eine halbe Stunde für die Offline-Vorbereitung, da die übrigen Schritte während der LC-Läufe ohne zusätzlichen Zeitaufwand durchgeführt werden.
Die Analyse der oberen H2O/MeOH -Fraktionen wurde am UHPLC-System 1 mit Online-Verdünnung und Standardzugabe durch den RTC-Roboter und im Wechsel des pH-Wertes der mobilen Phasen durchgeführt. Die H2O/MeOH-Fraktionen enthalten ca. 50 % MeOH. Daher ist eine Online-Verdünnung erforderlich, um den organischen Gehalt im Probenlösungsmittel zu reduzieren. Verschiedene Verdünnungsfaktoren, bei gleicher Injektionsmenge, wurden getestet. Bei polaren Verbindungen werden die Peaks bei Injektionen von mehr als 5 μL breiter, wie die Spur (XIC) von Adenin in Abb. 2 zeigt. Das Peakflächenverhältnis für einzelne Verbindungen blieb jedoch bis zu 10 % MeOH im Probenlösungsmittel ausreichend, selbst bei einem Injektionsvolumen von 45 μL. Für lipophile Verbindungen blieben die Peakbreiten mit Injektionen von 45 μL bei 0,1 min, aber es war ein höherer organischer Gehalt im Probenlösungsmittel erforderlich.  Um einen weiten Bereich an pKa-Werten abzudecken (Tab. 1), wurden die oberen (wässrigen) Anteile mit zwei verschiedenen mobilen Phasen (pH 3,0 und pH 8,3) analysiert, um die Retention bestimmter polarer Verbindungen wie Adenin und Nikotin zu verbessern (Abb. 3). Bei Wechsel zwischen den mobilen Phasen, war auf eine ausreichende Rekonditionierungszeit zu achten. Daher wurde das Einspritzschema B gegenüber C bevorzugt (Abb. 3).
Bei hochpolaren Verbindungen zeigte sich, dass ein hoher organischer Gehalt oder ein großes Injektionsvolumen schädlich für die Peakform sind. Umgekehrt wurden bei lipophilen Verbindungen Verluste beobachtet, die auf eine schlechte Löslichkeit bei hohen Wassergehalten zurückzuführen waren, wie z. B. solche mit nur 5 oder 10 % Methanol. Bei anderen Verbindungen wurden jedoch konsistente Ergebnisse über alle Verdünnungsfaktoren hinweg beobachtet.
 
Zusammenfassung
In der Metabolomanalyse ist eine gute Reproduzierbarkeit der Analysenergebnisse ein zentraler Faktor. Gleichzeitig fallen typischerweise viele Proben an. Exemplarisch konnte hier anhand der Bligh-Dyer-Extraktion von Gewebeproben und Zellen gezeigt werden, dass die Automatisierung der Probenvorbereitung die Reproduzierbarkeit, bei gleichzeitiger Minimierung des Zeitaufwandes, deutlich erhöht.
 
 
Autoren
E. Varesio1, S. Jahn1, S. Cudré1, G. Hopfgartner1, R. Picenoni2, and G. Boehm2
 
Zugehörigkeiten
1Life Sciences Mass Spectrometry,
Universität Genf, Schweiz
2CTC Analytics AG, Zwingen, Schweiz
 
 
Kontakt   
Dr. Guenter Boehm

CTC Analytics AG
Zwingen, Schweiz
gboehm@ctc.ch
 
 

 

Literatur
[1] S.K. Jensen, Improved Bligh and Dyer extraction procedure, Lipid Technology 2008, 20 (12):280-281

[2] J. Folch, J. Biol. Chem. 1957, 226: 497

[3] E.G. Bligh and W.J. Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 1959, 37: 911-917

 

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