Wer nicht färben will muss fühlen

Viskoelastische Eigenschaften von Zellen zur schnellen markierungsfreien Analyse

  • Abb. 1: Prinzip des dynamischen Trackings. a) Skizze des mikrofluidischen Systems (oben) und Programmablaufplan (unten). Aus dem Betrachtungsausschnitt über das gesamte Kanalgebiet werden zur Datenreduktion Teile ausgeschnitten. Um die Zelle sicher verfolgen zu können, wird der nächste Ausschnitt (ROI) um ca. die Hälfte des Bildausschnitts nach rechts bewegt, falls der Massenmittelpunkt einen Schwellwert von 70% im Bild überschreitet, wie im Schema beispielhaft die Zelle vom Zeitpunkt tk+1 zu tk+2. b) Stress entlang der Mittellinie im Kanal über die axiale Position z für drei verschiedene Flussraten ohne ein Objekt im Kanal. Am Kanalein- und -ausgang erreicht der Stress spitzenhafte Maxima auf Grund der positiven bzw. negativen Beschleunigung, während der Scherstress innerhalb des Kanals weit geringer und konstant ist. c) Beispiel einer HL60 Zelle, welche durch einen 30 µm Kanal fließt. Für die dargestellte Zeitserie wurden 19 Einzelaufnahmen aus insgesamt 92 ausgewählt. d) Simulation des Stresses an der Oberfläche einer verformten HL60 Zelle in einem 30 µm Kanal mittels Computersimulation (In Anlehnung an [1]).
  • Abb. 2: Fourieranalyse der Zellkontur a) Fourier-Zerlegung in Moden der Kontur. Erste fünf Moden der Zellkontur der mittleren Verformung von mehr als 1.500 HL60 Zellen einzeln und Gesamtverformung aus den ersten zehn Moden (blau). Als Referenz wurde die nullte Mode (Kreis mit mittlerem Radius der Form) im Hintergrund schwarz strichliert dargestellt. b) Deformation der rekonstruierten Konturen aller geraden Fourier-Koeffizienten (oben) und aller ungeraden Moden (unten). Die roten Linien zeigen den Kanalein- und -ausgang. Darüber sind jeweils im Kanal die rekonstruierten, über alle Zellen gemittelten Konturen dargestellt. c) Deformation der Rekonstruktion aller Moden. Betrachtet wurden die ersten zehn Fourier-Komponenten. Die roten Linien zeigen den Kanalein- und -ausgang. Der Fehler der Kontur, beschrieben durch die ersten zehn Moden relativ zu den Originaldaten, beträgt dabei um 1% (Einfügung) (In Anlehnung an [1]).
Erweiterung einer rheologischen Messmethode
Die mechanischen Eigenschaften von Zellen, d.h. Elastizität und Viskosität, sind in der Physik und den Lebenswissenschaften von immer größerer Bedeutung, deren grundlegende Funktion zu beschreiben. Während die Elastizität angibt, wie stark sich ein Objekt, z.B. ein Gummiball, unter einer bestimmten Kraft verformt, beschreibt die Viskosität dessen Fließverhalten. Zellen besitzen beide Eigenschaften und können diese Viskoelastizität je nach Situation aktiv ändern, bspw. wenn Immunzellen ein Bakterium verfolgen [2,3].
Aktuelle Standardverfahren der Biologie bedienen sich oftmals Farbstoffe oder anderer Verbindungen, um Zellen zu identifizieren und deren Funktion zu bestimmen. Ein typisches Beispiel ist die Fluoreszenzmikroskopie oder die Durchflusszytometrie, bei der Zellen oder Zellbestandteile angefärbt, durch Lichtanregung sichtbar gemacht und auf Grund von Bild- oder Videoaufnahmen analysiert werden. Im Gegensatz zu Fluoreszenzfarbstoffen ist eine mechanische Analyse von Zellen markierungsfrei. Sie nutzt intrinsische Materialeigenschaften, welche hauptsächlich durch das Zytoskelett, d.h. Aktin, Tubulin und intermediäre Filamente, bestimmt sind. Während die Zellmechanik bereits seit Jahrzehnten Gegenstand aktiver Forschung ist, wurde erst im Jahr 2015 mit der Real-Time Deformability Cytometry (RT-DC) erstmals eine Methode zu schnellen zellmechanischen Quantifizierung in Echtzeit vorgestellt, welche die bisherigen Einschränkungen, wie beispielsweise niedrigen Durchsatz, aufwändige Nachbearbeitung der Daten oder zeitversetzte Analyse, überwand [5]. Die RT-DC ermöglicht es, von Zellen in Suspension das Elastizitätsmodul bei einem Durchsatz von 1.000 Zellen pro Sekunde zu bestimmen.
Um jede einzelne Zelle viskoelastisch beschreiben zu können, stellen wir hier eine Erweiterung hin zur dynamischen Messung der Zellen vor, welche neben dem Elastizitätsmodul nun auch die Viskosität quantifiziert.
 
Messmethode
Zellen strömen in einer Pufferlösung durch einen mikrofluidischen Kanal (Abb. 1a,c), welcher eine quadratische Querschnittsfläche mit Kantenlänge 20 µm bzw.

30 µm aufweist. Der mikrofluidische Kanal wird mittels Softlithografie hergestellt, bestehend aus PDMS (Polydimethylsiloxan) und nach Oberflächenaktivierung kovalent an einen Objektträger aus Glas gebunden. Der Kanal ist auf einem invertierten Mikroskop befestigt und besitzt zwei Eingänge und einen Ausgang, welche jeweils mit Schläuchen verbunden werden. Sowohl die Zellen in Suspension als auch ein Hüllstrom zur Fokussierung der Probe, bestehend aus der gleichen Pufferlösung, werden durch eine Spritzenpumpe dosiert. Durch hydrodynamische Kräfte werden die Zellen im Kanal verformt und erreichen eine stationäre Form am Kanalende ähnlich eines Projektils, welches aus dem parabelförmigen Flussprofil resultiert (Abb. 1b,c). In Abb. 1d ist beispielhaft der Stress auf der Oberfläche einer Zelle am Ende des Kanals dargestellt. Eine Hochgeschwindigkeitskamera nimmt die verformten Zellen am Kanalende auf, die zugehörigen Schwarz-Weiß-Bilder werden berechnet und die Kontur der Zellen extrahiert. Über Zellumfang und die Fläche der Zelle wird ein Verformungsmesswert, die Deformation, berechnet. Mit Hilfe eines Modells kann hieraus das Elastizitätsmodul ermittelt werden [4], welches die Verformung und Größe einer Zelle mit gegebenen Randbedingungen wie Flussgeschwindigkeit, Kanalgröße und Fließverhalten der Pufferlösung verknüpft.

 
Dynamisches Tracking dRT-DC
Beim dynamischen Tracking der Zellen wird nun nicht nur eine Einzelaufnahme pro Zelle gemacht, sondern eine Bildfolge [1]. Damit erhält man die zeitliche Entwicklung der Zellverformung (Abb. 1c), was es erlaubt, zeitabhängige Materialparameter wie die Viskosität, also das Fließverhalten, abzuleiten.
Die Software zur Akquise und Auswertung der Bilder wurde entsprechend erweitert. Im aktiven Bildausschnitt der Kamera liegt nun nicht mehr lediglich das Kanalende sondern die gesamte Länge des Kanals inklusive Ein- und Auslass (Abb. 1a oben, c). Um eine Analyse in Echtzeit zu ermöglichen, müssen zur Reduktion der Datenrate kleiner Bildbereiche um die Zelle herum ausgeschnitten werden (ROI). Die Aufnahme beginnt am linken Bildrand, wo eine einfließende Zelle detektiert wird. Überschreitet ihr Massenmittelpunkt horizontal einen Schwellwert bei 70% im Bild, wird der Ausschnitt um einen halben Bildausschnitt nach rechts versetzt (Abb. 1a). In jedem Bildausschnitt wird die Position der Zelle, ihr Massenmittelpunkt und die Größe bestimmt sowie deren Deformation aus der Kontur berechnet.
In einer eigens für die dynamische RT-DC entwickelten Analyse-Software, implementiert in Matlab, werden die Konturen der Zellen zunächst bezüglich ihres Massenmittelpunkts in Polarkoordinaten überführt und auf diese Radiusfunktion eine Fourier-Transformation angewandt. Die Resultate der geraden sowie ungeraden Fourier-Koeffizienten werden separat zurücktransformiert und für die sich ergebenden Konturen jeweils die Deformation berechnet.
Fließt eine Zelle durch einen mikrofluidischen Kanal, reagiert sie auf zwei verschiedene Stressverteilungen. Zum einen wird sie am Eingang auf Grund der großen Beschleunigung sehr stark in Flussrichtung gestreckt. Innerhalb des Kanals reagiert sie hingegen auf den in der Stärke wesentlich geringeren, dafür aber konstanten hydrodynamische Scherstress, welcher die Zelle zu einer Form ähnlich eines Projektils verformt (Abb. 1c,d).
Die Zerlegung in Moden der Kontur (Abb. 2a) ist ausschließlich auf Symmetrieargumenten gegründet und so lässt sich zeigen, dass die Verformung rekonstruiert aus den geraden Fourier-Koeffizienten vor allem die Antwort auf den spitzenförmigen Stress am Eingang repräsentiert, wohingegen die Verformung, welche von den ungeraden Fourier-Komponenten abstammt, die zelluläre Antwort auf den konstanten Kanalstress darstellt (Abb. 2b). Betrachtet man lediglich die Deformation, welche vom Kanal herrührt, lässt sich die Verformung der Zelle als Antwort auf ein einfaches Experiment mit stufenförmigem Stress interpretieren. Wird an ein viskoelastisches Objekt ein stufenförmiger Stress angelegt, so fängt das Objekt sich ab diesem Zeitpunkt an hin zu einem Gleichgewichtswert zu verformen, wobei dieses Verhalten einer Exponentialfunktion folgt. Zeitlich aufgelöst lässt sich an die Deformation eine Exponentialfunktion fitten, aus welcher die zwei Parameter Amplitude und Zeitkonstante extrahiert werden. Aus der Amplitude wird über das bereits erwähnte Modell das Elastizitätsmodul berechnet. Aus der Zeitkonstante lässt sich die Viskosität ermitteln, wodurch jeder Zelle nun sowohl ein elastischer als auch ein viskoser Messwert zugeordnet werden kann. Die Zelle ist folglich viskoelastisch beschrieben.
Für die Berechnung des Elastizitätsmoduls werden neben der gemessenen Verformung sowie der Zellgröße, die Viskosität des umströmenden Mediums als auch die Kanalgröße benötigt. Um die Viskosität an der Zelloberfläche zu erhalten, werden Finite-Elemente-Simulationen in Comsol durchgeführt. Aus einer Simulation im Gleichgewichtszustand der Scher- und Normalkräfte an der Zelloberfläche wird der Stress auf der Oberfläche ermittelt. Hierbei wird das scherverdünnende Verhalten der Pufferlösung berücksichtigt, welche zu diesem Zweck mit einem Rheometer charakterisiert und durch den Fit einer Potenzfunktion beschrieben wird.
 
Anwendungen
Anhand von HL60 Zellen, einer myeloiden Leukämie-Zelllinie, demonstrieren wir unsere Methode und zeigen, dass die dynamische RT-DC Veränderungen des Zytoskeletts messen kann, bspw. nach der Depolymerisierung von Aktinfilamenten. Der schnelle Probendurchsatz unserer Methode erlaubt statistisch robuste Aussagen aus drei Replikaten von insgesamt mehr als 2.500 Zellen. Nach der Depolymerisierung von Aktin mit 1 µM Cytochalasin D zeigen die Zellen ein signifikant kleineres Elastizitätsmodul und eine kleinere Viskosität gegenüber der unbehandelten Kontrolle.
In einem zweiten Versuch wenden wir unsere Messtechnik auf periphere Blutzellen an. Da die vorgestellte Methode Materialeigenschaften unabhängig von der Zellform extrahieren kann, sind wir in der Lage, Elastizitäts- und Viskositätswerte der wichtigsten Subpopulationen des Blutes, Erythrozyten, Granulozyten und PBMC (mononukleäre Zellen des peripheren Blutes), in nur einer Messung bei hohem Durchsatz zu vergleichen. Außerdem untersuchen wir B- und T-Zellen, Subpopulationen der Lymphozyten, und konnten zeigen, dass wir diese statistisch unterscheiden können.
 

Autoren
Bob Fregin1,4, Fabian Czerwinski1, Doreen Biedenweg2, Salvatore Girardo3, Stefan Groß2,4, Konstanze Aurich2, Oliver Otto1,4

Zugehörigkeiten
1 Zentrum für Innovationskompetenz: Humorale Immunreaktionen bei kardiovaskulären Erkrankungen, Universität Greifswald, Deutschland
2 Universitätsmedizin Greifswald, Deutschland
3 Biotechnology Center, Center for Molecular and Cellular Bioengineering, Technische Universität Dresden, Deutschland
4 Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung e.V., Standort Greifswald, Universitätsmedizin Greifswald, Deutschland

Kontakt
Dr. Oliver Otto

Leiter der Biomechanik-Gruppe im ZIK HIKE
Universität Greifswald
Greifswald, Deutschland
oliver.otto@uni-greifswald.de
www.hike-autoimmunity.de
www.biomech-hgw.org
 

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Literatur

[1] Fregin, B., Czerwinski, F., Biedenweg, D., Girardo, S., Gross, S., Aurich, K., & Otto, O. (2019). High-throughput single-cell rheology in complex samples by dynamic real-time deformability cytometry. Nature Communications, 10(1). https://doi.org/10.1038/s41467-019-08370-3
[2] Guck, J., & Chilvers, E. R. (2013). Mechanics meets medicine. Science Translational Medicine, 5(212), 212fs41. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3007731
[3] Lautenschläger, F., Paschke, S., Schinkinger, S., Bruel, A., Beil, M., & Guck, J. (2009). The regulatory role of cell mechanics for migration of differentiating myeloid cells ¨, 106(37).
[4] Mietke, A., Otto, O., Girardo, S., Rosendahl, P., Taubenberger, A., Golfier, S., … Fischer-Friedrich, E. (2015). Extracting Cell Stiffness from Real-Time Deformability Cytometry: Theory and Experiment. Biophysical Journal, 109(10), 2023–2036. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.09.006
[5] Otto, O., Rosendahl, P., Mietke, A., Golfier, S., Herold, C., Klaue, D., … Guck, J. (2015). Real-time deformability cytometry: on-the-fly cell mechanical phenotyping. Nature Methods, 12(3), 199–202, 4 p following 202. https://doi.org/10.1038/nmeth.3281
 

 

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